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NAD-蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)活性檢測(cè)試劑盒說明書（分光光度法）                                                                  

貨號(hào)：LE-1-335

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，線粒體中 MDH 是 TCA 循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中 MDH 催化草酰乙酸形成蘋果 酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物，  連接多條重要的代謝途徑。因此 ，MDH  在細(xì)胞多種生 理活動(dòng)中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧 代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH 分為 NAD-依賴的 MDH 和 NADP-依賴的 MDH，細(xì)菌中通常只含有 NAD-MDH，在真核細(xì)胞中，NAD-MDH 分布于細(xì)胞質(zhì)和線粒體 中。

測(cè)定原理：

NAD-MDH 催化 NADH 還原草酰乙酸生成蘋果酸，導(dǎo)致 340nm 處光吸收下降。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：提取液 60 mL×1 瓶，在 4℃保存；

試劑二：液體 50 mL×1 瓶，在 4℃保存；

試劑三：粉劑×2 支，-20℃保存； 臨用前加入 300μL 蒸餾水，充分溶解待用 ，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×2 支，-20℃保存； 臨用前加入 300μL 蒸餾水，充分溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

樣本測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 1000~5000： 1 的比例（建議 2000 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 試劑一）， 進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑二在37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。

3、操作表：

將上述試劑按順序加入 1 mL 石英比色皿中，混勻后立即在 340 nm 波長(zhǎng)下記錄初始吸光度A1 和反應(yīng) 1min 后的吸光度 A2，計(jì)算 ΔA=A1-A2。

注意：若 A1-A2 大于 0.5，需將樣本用提取液稀釋，使 A1-A2 小于 0.5 ，可提高檢測(cè)靈敏度。 計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

NAD-MDH 活力單位的計(jì)算：

1、血清（漿）NAD-MDH 活力的計(jì)算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 

NAD-MDH（ nmol/min/mL）=[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T

=6430×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD-MDH 活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/g  鮮重） =[ΔA×V 反總 ÷ (ε×d）×10⁹]÷（W×V 樣÷V 樣總） ÷T 

=6430×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷（2000×V 樣÷V 樣總）÷T

=3.215×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，8×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm； d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.02mL；V 樣總：加入提取液體積 ， 1 mL； T： 反應(yīng)時(shí)間， 1  min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；2000：細(xì)胞或細(xì)菌 總數(shù)，2000 萬。