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丙酮酸脫氫酶（PDH）活性檢測試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-214

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

PDH（EC 1.2.4.1）廣泛存在于動物 、植物 、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)催 化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，催化丙酮酸脫梭生成羥乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來。

測定原理：

PDH 催化丙酮酸脫氫， 同時還原 2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP） ，從而導(dǎo)致 600nm 光吸收的減少。

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體 50ml ×1 瓶，-20℃保存；

試劑二：液體 10ml ×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：液體 1ml ×1 瓶，-20℃保存；

試劑四：液體 50ml ×1 瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑 ×1 瓶，4℃保存；

試劑六：粉劑 ×1 瓶，4℃保存；

試劑七：粉劑 ×1 瓶，4℃保存；

試劑八：粉劑 ×1 瓶，4℃保存；

工作液的配制：臨用前把試劑五 、試劑六 、試劑七和試劑八轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解待用；用不完的 試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

自備儀器和用品：

可見分光光度計 、水浴鍋 、 臺式離心機 、可調(diào)式移液器 、 1 ml 玻璃比色皿 、研缽 、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織 、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、稱取約 0. 1g 組織或收集 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿 600g ，4℃離心 5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g ，4℃離心 10min。

4、上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的 PDH（此步可選做）。

5、在步驟 ④ 的沉淀中加入 200μl 試劑二和 2μl  試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W ，超聲 3 秒，間 隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體 PDH 活性測定。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 605nm 處 ，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種） 中孵育 5min。

3、在1ml 玻璃比色皿中加入 50μl 樣本和 900μl 工作液，混勻，立即記錄 605nm 處初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，計算ΔA=A1-A2。

PDH 活性計算：

1、按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr)÷T

=905×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH 活性（nmol/min/g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T

= 182.8×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 

PDH 活性（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.366×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，9.5×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2. 1×10⁴ L / mol /cm；d： 比色皿 光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 ml；V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時間， 1 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。