自拍偷自拍亚洲精品第|精品无码一级黄色视频|国产亚洲一区二区不卡片|色综合天天综合网国产人|天码精品专区一区二区三区|日韩免费无码专区精品观看|国产女主播精品大秀系列在线|国产欧美一区二区三区另类精品

貨號：LE-1-232

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

PK（EC  2.7.1.40 ）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中， 催化糖酵解過程中的最 后一步反應，是糖酵解過程中的主要限速酶之一，也是產(chǎn)生 ATP  的關(guān)鍵酶之一，因此測定 PK 活性具有重要意義。

測定原理

PK 催化磷酸烯醇式丙酮酸和 ADP 生成 ATP 和丙酮酸，乳酸脫氫酶進一步催化 NADH 和丙 酮酸生成乳酸和 NAD+，在 340nm 下測定 NADH 下降速率，即可反映 PK 活性。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計、臺式離心機、 水浴鍋、可調(diào)式移液器、 1mL  石英比色皿、研缽、冰和蒸 餾水

試劑的組成和配制

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存;

試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×2 瓶，-20℃保存；

試劑三：液體 25μL×2 支，4℃保存；

樣本的前處理

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟

1、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1）試劑二的配制：臨用前取試劑二一瓶，加入 22.5mL 試劑一和 2.65mL 蒸餾水充分溶解， 置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 5min； 現(xiàn)配現(xiàn)用。

（2）試劑三的配制： 臨用前取試劑三一支，加入 1.5mL 蒸餾水充分溶解待用； 現(xiàn)配現(xiàn)用。

（3）在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本、50μL 試劑三和900μL 試劑二，混勻，立即 記錄 340nm 處 20s 時的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2 ，計算 ΔA=A1-A2。

PK 活性計算

1、血清（漿）中 PK 活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。 

PK（nmol/min/mL） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T

=2613×ΔA

2、組織、細菌或細胞中PK 活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

PK（nmol/min /mg prot） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=2613×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

PK（nmol/min /g  鮮重） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T

=2613×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

PK（nmol/min /10⁴ cell） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=5.226×ΔA

V 反總：反應體系總體積，9.75×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL； T： 反應時間，2min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細菌或細胞總  數(shù)，500 萬。