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腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)（分光光度法-25管/24樣）

貨號(hào)：LE-1-089

測(cè)定意義

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸與 ATP 反應(yīng)生成淀粉合成的直接 前體 ADPG ，是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。

測(cè)定原理

AGP 催化的逆向反應(yīng)生成 G1P ，在反應(yīng)體系中添加的磷酸己糖變位酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫 酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH ，340nm 下測(cè)定 NADPH 增加速率， 即可計(jì)算 AGP 活性。

需自備的的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、 1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸 餾水

試劑的組成和配制

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存; 

試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入 9mL 蒸餾水充分溶解備用； 用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：粉劑×1瓶， -20℃保存；臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

粗酶液制備

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。 10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一置 30℃保溫 10min 以上。

3、在 EP 管中按順序加入下列試劑

混勻，30℃保溫 15 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴迅速冷卻后，4000g4℃ 離心 5min，取上清液，在 1mL 石英比色皿中依次加入下列試劑

混勻后，立即于 340 nm波長(zhǎng)下記錄初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

AGP 活性計(jì)算

1、按樣本蛋白蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活性單位。 

AGP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷  ( ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)

=2813×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

AGP（nmol/min /g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷  ( ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T×稀釋倍數(shù)

=2813×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1×10^-3 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³  L / mol /cm； d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.04mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL； T： 反應(yīng)時(shí)間，2 min；稀釋倍數(shù)： 1.4；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度， mg/mL；W：樣本質(zhì)量。