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海藻糖酶（ Trehalase ，THL）試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-222

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

THL（EC 3.2.1.28）廣泛存在于動物 、植物 、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中 。海藻糖酶主要功能在于生物體分 解海藻糖生成葡萄糖而直接用于能量供應(yīng)。

測定原理：

THL 催化海藻糖產(chǎn)生葡萄糖，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并產(chǎn)生過氧化氫；過氧化物 酶催化過氧化氫氧化 4-氨基安替比林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在 505 nm 有特征吸收峰， 以此反映 THL 活性。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 30mL ×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 10mL ×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 25mL ×1 瓶，4℃保存；

試劑三：液體 25ml ×1 瓶 ，4℃保存；（若出現(xiàn)結(jié)冰現(xiàn)象，可 37℃水浴溶解后使用）

自備儀器和用品：

可見分光光度計 、水浴鍋 、可調(diào)式移液器 、 1ml 玻璃比色皿 、研缽 、冰和蒸餾水。

樣品測定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌或細(xì)胞的處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（ 10⁴ 個） ：提 取液體積（ml）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液） ，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì) 胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3S， 間隔 10S，重復(fù) 30 次） ；8000g，4℃離心 10min，取上清，置   冰上待測。

2、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1ml 提取液） ，冰浴中勻漿 。8000g  ，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）的處理：按照血清（漿）體積（ml） ：提取液體積(ml)為 1 ：5~ 10 的比例（建議取 0. 1ml 血 清（漿）加入 1ml 提取液），冰浴中勻漿 。8000g ，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 505nm，蒸餾水調(diào)零。

2、調(diào)節(jié)水浴鍋至 95 度。

3、工作液的配制：使用前將試劑二和試劑三 1:1 等體積混合，用多少配多少。

4、加樣表（在 EP 管中依次加入下列試劑）：

45℃水浴，準(zhǔn)確反應(yīng) 15min，95℃水浴 5 分鐘終止反應(yīng)，得混合液(若出現(xiàn)沉淀可 10000g 4℃離心 10min 后取上清)。

混勻，置 37℃（哺乳動物）或 25'C（其它物種）保溫 15min 后，于 505nm 波長處讀取吸光度 。計算 ΔA=A 測定管-A 對照管 。每個測定管需設(shè)一個對照管。

THL 活力計算：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為 y = 0.4858x - 0.0042，R² = 0.9999；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度( μmol/ml），y 為吸光值。

2、按照蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T×1000 

=366× (ΔA+0.0042) ÷Cpr

3、按樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/g  鮮重)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T×1000 

=366×(ΔA+0.0042)÷W

4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/10⁴ cell)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反總÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T×1000 

=0.732×(ΔA+0.0042)

5、按血清（漿）體積計算

單位的定義：每 ml 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

THL 活力(nmol/min/ml)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反總÷(V 液  ×V 樣÷V 樣總) ÷T×1000 

=3660×(ΔA+0.0042)

V 樣：加入樣本體積：0.09ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.24ml；V 液： 加入血清（漿）體積，0. 1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：