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細胞色素 b5( Cytochrome b5)含量測定試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-370

正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

胞色素 P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。細胞色素 P450 和細胞色素 b5 是 P450 酶系的兩個血紅素蛋白，其比值的變化與 P450 代謝活性密切相關。

測定原理:

氧化型細胞色素 b5 經連二亞硫酸鈉還原后，在 424nm 處有最大吸收峰，通過測定 424nm 和 490nm 處吸光值的差異，即可計算出細胞色素 b5 的含量。

自備儀器和用品:

可見分光光度計、普通離心機，超速離心機、可調式移液槍、 1mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制:

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加 100mL 蒸餾水，充分溶解。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存;

工作液配制: 臨用前配制，戴一次性手套，小心打開試劑三瓶蓋，加試劑二 50  mL 充分溶 解，4℃避光可保存 1 周。

樣品中細胞色素 b5 提取:

1、除去細胞核，線粒體等大分子物質: 稱約 0.5g 組織，加入 1mL 試劑一，冰上充分研磨， 10 000g 4℃離心 30min ，取上清液，轉入超速離心管中。

2、粗制微粒體: 100 000g，4℃離心 60min ，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質: 向步驟 2 的沉淀中加 1mL 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g 離心 30min ，棄上清液。

4、待測液: 向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5mL，蓋緊后充分震蕩溶解， 即待測液，該待測 液需當天測定。

細胞色素 b5 含量測定操作:

1、分光光度計預熱 30 min。

2、工作液置于 25℃水浴中預熱 30 min。

3、空白管:  取 1mL 玻璃比色皿，加入 50  μ L 蒸餾水， 1000μ L 工作液，室溫靜置 2 min， 424nm 和490nm 處吸光值，424nm 處吸光值記為 A 空白管 1 ，490nm 處吸光值記為 A 空白管 2 。△A 空白管= A 空白管 1- A 空白管 2

4、測定管:  取 1mL 玻璃比色皿，加入 50 μ L 待測液， 1000μ L 工作液，室溫靜置 2 min ， 424nm 和490nm 處吸光值，424nm 處吸光值記為 A 測定管 1 ，490nm 處吸光值記為 A 測定 管 2 。△A 測定管= A 測定管 1- A 測定管 2。

注意:只需要做一個空白管。

樣品細胞色素 b5 含量計算公式:

1、按照蛋白濃度計算:

細胞色素 b5 含量(nmol/mg prot)=(△A 測定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總÷( Cpr×V 樣) 

= 0.123×(△A 測定管-△A 空白管)÷Cpr

2、按照樣本質量計算:

細胞色素 b5 含量(nmol/g 鮮重)=(△A 測定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×( V 樣總÷V 樣)÷W

= 0.0614×(△A 測定管-△A 空白管)÷W

ε: 還原型細胞色素 b5 納摩爾消光系數(shù)， 171×10^-3 L/nmol/cm; d:  比色皿光徑(cm)， 1cm; V 反總: 反應體系總體積， 1.05 m L=0.00105 L; Cpr: 待測液蛋白質濃度(mg/mL)， 需要 另外測定; V 樣: 加入反應體系中待測液體積，50 μ L=0.05 mL; V 樣總:  待測液總體積， 0.5 mL; W: 樣品質量，g。