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紅霉素-N-脫甲基酶（ERND）活性測定試劑盒說明書（分光光度法）
貨號：LE-1-369

正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

細胞色素 P450 酶是一組主要存在于肝臟的酶系,在外源物質(zhì)代謝中,尤其是藥物和毒物的代謝, 具有重要作用。ERND 在 P450 酶系中相當(dāng)于 CYP2B 亞型, 與藥物代謝的去甲基化 密切相關(guān)。CYP2B 具有催化底物形成非活性易于排泄的代謝產(chǎn)物而具有解毒作用,也可使某些藥物經(jīng) CYP2B 代謝活化。

測定原理:

ERND 催化紅霉素釋放甲醛, 通過 Nash 比色測定甲醛含量,  即可計算出 ERND 活性。

自備儀器和用品:

可見分光光度計、普通離心機, 超速離心機、可調(diào)式移液槍、 1mL  玻璃比色皿、蒸餾水和 冰。

試劑組成和配制:

試劑一：粉劑×1瓶, 4℃保存。臨用前加50 mL 蒸餾水溶解。

試劑二：液體×1瓶, 4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶, 4℃保存。臨用前加 2.6 mL 蒸餾水, 充分溶解。

試劑四：粉劑×1瓶, 4℃保存。臨用前加 2.6 mL 蒸餾水, 充分溶解。

試劑五：粉劑×1瓶, 4℃保存。臨用前, 加蒸餾水 9 mL 充分溶解。

試劑六：液體×1瓶, 4℃保存。

試劑七：液體×1瓶, 4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1瓶, -20℃保存。臨用前取 1.5mL EP 管,加入 10μl 標(biāo)準(zhǔn)液,加990μl 蒸餾水,混勻即為 0.05 mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)甲醛溶液,4℃保存。

粗酶液提取:

1、除去細胞核,線粒體等大分子物質(zhì): 稱約 0.5g 組織,加入 1mL 試劑一, 冰上充分研磨, 10 000g 4℃離心 30min , 取上清液,轉(zhuǎn)入超速離心管中。

2、粗制微粒體: 100 000g, 4℃,離心 60min , 棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì): 向步驟 2 的沉淀中加 1mL 試劑一, 蓋緊后充分震蕩溶解,100 000g 離心 30min ,棄上清液。

4、最終微粒體: 向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5mL, 充分震蕩溶解, 即粗酶液, 待測。該待測液需當(dāng)天使用。

測定操作:

1、分光光度計預(yù)熱 30 min 以上,  調(diào)節(jié)波長到 412 nm, 蒸餾水調(diào)零。

2、試劑二置于 37℃水浴中預(yù)熱 30 min。

3、對照管: 取 1 支 EP 管, 加入 50μL 粗酶液, 850μL 試劑二, 50μL 試劑三, 50μL 蒸餾水, 混勻后置于 37℃水浴保溫 30min; 立即加入 175μL 試劑五, 混勻后置于冰浴中 5min; 取出 后加入 175μL 試劑六,  混勻后室溫靜置 5min; 室溫 8000rpm 離心 5min;  取新的 EP 管, 加 入 500μL 上清液, 500μL 試劑七, 混勻后 60℃水浴 10min, 然后取出, 用冷水冷卻 5min , 于 412nm 測定光吸收, 記為 A 對照管。

4、測定管: 取 1 支 EP 管, 加入 50μL 粗酶液, 850μL 試劑二, 50μL 試劑三, 50μL 試劑四, 混勻后置于 37℃水浴保溫 30min; 立即加入 175μL 試劑五, 混勻后置于冰浴中 5min; 取出 后加入 175μL 試劑六,  混勻后室溫靜置 5min; 室溫 8000rpm 離心 5min;  取 1 支新 EP 管,加入 500μL 上清液, 500μL 試劑七, 混勻后 60℃水浴 10min, 然后取出, 用冷水冷卻 5min , 于 412nm 測定光吸收, 記為 A 測定管。

5、標(biāo)準(zhǔn)管：取 1 支 EP 管,加入 500μL 標(biāo)準(zhǔn)品, 500μL 試劑七, 混勻后 60℃水浴 10min , 然后取出, 用冷水冷卻 5min, 于 412nm 測定光吸收,記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。

注意：每個樣品都需要做對照管。

ERND 活性計算公式:

1、按照蛋白濃度計算:

活性單位定義: 37℃下,每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個酶活單位。

ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×( A 測定管 -A 對照管)÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷( Cpr×V 樣)÷T

= 45×( A 測定管 -A 對照管)÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr。

2、按照樣本質(zhì)量計算:

活性單位定義: 37℃下, 每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個酶活單位。

ERND 活性(nmol/min/g 鮮重) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×( A 測定管 -A 對照管)÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷( W×V 樣)÷T

= 45×( A 測定管 -A 對照管)÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)品: 0.05 mmol/L=50μmol/L; V 標(biāo)準(zhǔn)品: 500μL=0.0005 L; 稀釋倍數(shù): V 反總÷V 上清液= ( 50+850 +50+50+175+175) ÷500=2.7; Cpr: 粗酶液蛋白質(zhì)濃度, mg/mL,  需要另外測 定, 建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒; V 樣: 加入粗酶液體積, 50μL=0.05mL; W: 樣本質(zhì)量, g; T: 催化反應(yīng)時間, 30min。