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貨號(hào)：LE-1-368

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

細(xì)胞色素 P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和  毒物的代謝。AH 在 P450 酶系中相當(dāng)于 CYP2E1 亞型，CYP2E1 不僅參與了藥物的代謝，而且還能催化多 種前致癌物和前毒物的活化過程。

測(cè)定原理：

AH 催化苯胺羥化后產(chǎn)生的 4-氨基酚，進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榉?吲哚復(fù)合物，在 630nm 處有特征吸收峰；通 過測(cè)定 630nm 吸光度增加速率，來計(jì)算AH 活性。

試劑盒的組成和配置：

試劑一：粉劑×1 瓶 ，4℃保存 。 臨用前加入 50ml 蒸餾水，充分溶解。 

試劑二：液體×1 瓶 ，4℃保存 。

試劑三：粉劑×1 瓶 ，4℃保存 。 臨用前加入 26ml 蒸餾水，充分溶解。 

試劑四：粉劑×1 瓶 ，4℃保存 。 臨用前加入 13ml 蒸餾水，充分溶解。

試劑五：液體×1 瓶 ，4℃保存 。

試劑六：粉劑×1 瓶（腐蝕性試劑） ，4℃避光保存 。臨用前加入 26ml 蒸餾水，充分溶解。

試劑七：粉劑×1 瓶 ，4℃保存 。 臨用前加入 26ml 蒸餾水充分溶解。

標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1 瓶 ，10μmol/L，4℃避光保存。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì) 、普通離心機(jī) 、超速離心機(jī) 、可調(diào)式移液槍 、 1ml 玻璃比色皿 、雙蒸水和冰。

粗酶液提?。?/span>

1、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約 0.5g 組織，加入 1ml 試劑一 ，冰上充分研磨，10 000g 4℃, 離心 30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。

2、粗制微粒體：  100 000g 4℃,   離心 60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1ml 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g 離心 30min，棄 上清液。

4、最終微粒體： 向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5ml，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測(cè)。

測(cè)定操作：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 630 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑三置于 37℃水浴中預(yù)熱 30min。

3、試劑五置于冰浴預(yù)冷 30min。

4、標(biāo)準(zhǔn)管：取 1.5ml EP 管，加入 500μl  標(biāo)準(zhǔn)液，500μl 試劑六，500μl 試劑七，混勻后室溫靜置 30min， 于 630 nm 測(cè)定光吸收，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。

5、對(duì)照管：取 1 支 1.5ml EP 管，加入 250μl 粗酶液，500μl 試劑三，250μl 蒸餾水，混勻后 37℃水浴中保 溫 30min；再加入 500μl 試劑五，混勻后冰浴 5min，11000rpm，4℃,  離心 10min；取 500μl 上清液，加入 1 支新的 1.5ml EP 管；再加入 500μl 試劑六，500μl 試劑七，混勻后室溫靜置 30min，于 630 nm 測(cè)定光吸 收 ，記為 A 對(duì)照管。

6、測(cè)定管：取 1 支 1.5ml EP 管，加入 250μl 粗酶液，500μl 試劑三，250μl 試劑四，混勻后 37℃水浴中保 溫 30min；再加入 500μl 試劑五，混勻后冰浴 5min，11000rpm，4℃,   離心 10min；取 500μl 上清液，加入 1 支新的 1.5ml EP 管；再加入 500μl 試劑六，500μl 試劑七，混勻后室溫靜置 30min，于 630 nm 測(cè)定光吸 收 ，記為 A 測(cè)定管。

AH 活性計(jì)算公式：

1、按照蛋白濃度計(jì)算:

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 4-氨基酚為 1 個(gè)酶活單位。

AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V 樣）÷T

= 2×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算:

活性單位定義：37℃中每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 4-氨基酚為 1 個(gè)酶活單位。

AH 活性(nmol/min/g  鮮重)= C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(W×V 樣)÷T 

= 2×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)品： 10μmol/L；V 標(biāo)準(zhǔn)品：500μl=0.0005L；稀釋倍數(shù)：V 反總÷V 上清液=1500μl÷500μl=3；Cpr： 粗酶液蛋白質(zhì)濃度，mg/ml，需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；V 樣：加入反 應(yīng)體系中粗酶液體積，250μl=0.25ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。