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木質(zhì)素過氧化物酶（Lip）試劑盒說明書（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-386

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

木質(zhì)素過氧化物酶（EC1.11.1.14）是一種含亞鐵血紅素的過氧化物酶，屬于木質(zhì)素降解酶系，在木質(zhì)素生物降解、造紙工業(yè)、紡織工業(yè)、芳香化合物轉(zhuǎn)化與降解及環(huán)境污染控制等方面具有較大的應(yīng)用潛力。

測(cè)定原理

木質(zhì)素過氧化物酶催化天青脫甲基，在 651nm 處測(cè)定吸光值減少。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、研缽、低溫離心機(jī)、分光光度計(jì)、1 mL 玻璃比色皿、可調(diào)式移液器、冰。

試劑組成和配制

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃ 保存；臨用前加入  80mL 蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑4℃ 保存 1個(gè)月。

試劑二：液體 12mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體 12mL×1 瓶，4℃保存。

酶液提取

1、組織：按照質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1mL 試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿后于 4℃ , 10000g 離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000 ：1  的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒， 總時(shí)間 3min）；然后 4℃ ,10000g 離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3、培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 651nm，蒸餾水調(diào)零。

2、臨用前按每個(gè)樣本試劑一：試劑二：試劑三= 400:200:200  (μL）的比例配制工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3、在 1mL 玻璃比色皿中依次加入如下試劑

酶活計(jì)算公式

1、按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A651 變化 0.02 為一個(gè)酶活力單位。 

LiP 活性（U/mg prot）= ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.02÷T

=125×ΔA÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A651 變化 0.02 為一個(gè)酶活力單位。

LiP 活性（U/g  鮮重）=ΔA×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷0.02÷T

=125×ΔA÷W

3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A651 變化 0.02 為一個(gè)酶活力單位。

LiP 活性（U/10⁴ cell）=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.02÷T

=0.25×ΔA

4、按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每 mL 血清（漿）在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A651 變化 0.02 為一個(gè)酶活力單 位。

LiP 活性（U/mL）=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.02÷T

=125×ΔA

V 反總：反應(yīng)總體積，1mL；V 樣：反應(yīng)中樣本體積，0.2mL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2min