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漆酶活性檢測(cè)試劑盒說明書（分光光度法）
貨號(hào)：LE-1-380

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

漆酶（CE1.10.3.2 ）是一種含銅的多酚氧化酶，屬于銅藍(lán)氧化酶家族，廣泛分布于真菌和高 等植物中，具有較強(qiáng)的氧化還原能力，在紙漿生物漂白，環(huán)境污染物降解和木質(zhì)纖維素降解以及生物檢測(cè)方面有非常廣泛的應(yīng)用。

測(cè)定原理

漆酶分解底物 ABTS 產(chǎn)生 ABTS  自由基，在 420nm 處的吸光系數(shù)遠(yuǎn)大于底物 ABTS，測(cè)定 ABTS 自由基的增加速率，可計(jì)算得漆酶活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)、 1 mL 玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

工作液：粉劑×1 瓶，4℃避光保存，臨用前加25mL 試劑一溶解； 用不完的試劑 4℃保存一周。

酶液提取

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。 12000g 4℃離心30min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、細(xì)胞： 按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）： 提取液體積（mL）為 500~1000： 1  的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液）， 冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒， 總時(shí)間 3min）； 然后 4℃, 10000g 離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3、培養(yǎng)液：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作表

注意：

1、極少數(shù)樣本在 60℃水浴 20min 后會(huì)出現(xiàn)沉淀，可經(jīng)過 8000g  25℃離心 10min 后，取上清檢測(cè)，例如成熟的水稻葉片樣本。

2、為確保檢測(cè)準(zhǔn)確性，若 ΔA 大于 2，將樣本用提取液稀釋 2~10 倍后重新檢測(cè)，計(jì)算公式乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

酶活性計(jì)算公式

1、按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min/mg port）=△A÷（ε×d）×V 反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 9.26×△ A÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /g  鮮重）=△A÷（ε×d）×V 反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T

= 9.26×△ A÷W

3、 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /10⁴ cell）=△A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）÷T

= 9.26×△ A÷細(xì)胞數(shù)量

4、 按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每升培養(yǎng)液每分鐘氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min/L）=△A÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T

= 9260×△ A

ε：ABTS  毫摩爾消光系數(shù)：36L/mmol/cm； d：比色皿光徑， 1cm；V 反總：反應(yīng)總體積， 1mL；V 樣：反應(yīng)中樣本體積，0.15mL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；Cpr：樣本蛋白 濃度，mg/mL；W ，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間， 20min