產(chǎn)品名稱：異檸檬酸裂解酶(ICL)試劑盒
產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣,100管/96樣
產(chǎn)品貨號：LE-1-390,LE-2-390
產(chǎn)品報價：
免費咨詢：0551-66107970
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貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
檢測方法 |
規(guī)格 |
售價（元） |
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LE-1-390 |
異檸檬酸裂解酶（ICL)測試盒 |
分光光度法 |
50管/48樣 |
800 |
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LE-2-390 |
異檸檬酸裂解酶（ICL)測試盒 |
微量法 |
100管/96樣 |
1500 |
異檸檬酸裂解酶（ICL）活性檢測試劑盒說明書（分光光度法）
貨號：LE-1-390
正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
ICL（EC4.1.3.1）主要存在于植物和微生物中，油料作物種子在萌發(fā)過程中，通過乙醛酸循環(huán)及其他 過程將脂肪轉(zhuǎn)變成碳水化合物 。ICL 是乙醛酸循環(huán)的關鍵酶之一。
測定原理：
ICL 催化異檸檬酸降解為乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和 NADH 在 LDH 的作用下生成乙醇和NAD，NADH 在 340nm 下有特征吸收峰，監(jiān)測 340nm 吸光度的減小速率可間接反應 ICL 活性。
試劑組成和配制：
提取液：液體 50ml×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體 15ml×1 瓶，4℃保存；
試劑二：液體 15ml×1 瓶，4℃保存；
試劑三：粉劑 ×3 瓶 ，-20℃保存；臨用前每瓶加入 5ml 蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑仍-20℃ 保存；
試劑四：粉劑 ×3 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 5ml 蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后 -20℃保存，禁止反復凍融；
試劑五：液體 800μl ×2 支，4℃保存；臨用前每支加入 560μl 蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑仍 4℃保存；
試劑六：粉劑 ×3 瓶，4℃保存；臨用前每瓶加入 5ml 蒸餾水，充分混勻待用。用不完的試劑-20℃保存。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計 、 臺式離心機 、水浴鍋 、移液器 、 1ml 石英比色皿 、研缽 、冰和蒸餾水
樣本的前處理：
1 、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（ 104 個） ：提取液體積（ml） 為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液） ，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s， 間隔 10s，重復 30 次） ； 15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
2 、組織：按照組織質(zhì)量（ g）：提取液體積(ml)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1ml 提取液）， 進行冰浴勻漿 。 15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟：
1、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 570nm，蒸餾水調(diào)零。
2、加樣表(在 1.5ml 棕色 EP 管中按下表依次加樣）：
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試劑 |
測定管 |
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試劑一 ( μl） |
300 |
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試劑二 ( μl） |
250 |
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試劑三 ( μl） |
300 |
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試劑四 ( μl） |
300 |
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試劑五 ( μl） |
20 |
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樣本 ( μl） |
50 |
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試劑六 ( μl） |
300 |
將上述試劑按順序加入 1 ml 玻璃比色皿中，加試劑六的同時開始計時，在 340nm 波長下記錄 20 秒時 的初始吸光度 A1 和 2 分 20 秒時的吸光度 A2，計算ΔA=A1-A2。
注意：
若一次性測定樣本較多，可將試劑一、二、三 、四、五和樣本按比例配成混合液，在 37℃（哺乳動物） 或 25℃（其它物種）水浴 5min 以上，測定時加入 1220μl 混合液和 300μl 試劑六測定。
ICL 活性計算：
1、按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白中每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。
ICL（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T
=2443×ΔA÷Cpr
2、按樣本鮮重計算：
單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。
ICL（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T
=2443×ΔA÷W
3、按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。
ICL（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T
=4.886×ΔA
V 反總：反應體系總體積，1.52×10-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d： 比色皿 光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時間，2 min；Cpr： 樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。
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