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果膠酶（pectinase）試劑盒說(shuō)明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-321

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

果膠酶（pectinase）是一類分解果膠質(zhì)酶類的總稱，包括原果膠酶，果膠酯酶，多聚半乳糖  醛酸酶和果膠裂解酶四大類，廣泛存在于植物果實(shí)和微生物中，主要用于食品、釀酒、環(huán)保、 醫(yī)藥、紡織及日化用品行業(yè)。

測(cè)定原理

果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸，具有還原性醛基，與DNS 試劑反應(yīng)生成紅棕色物質(zhì)，在 540nm 有特征吸收峰，測(cè)定540nm 處吸光值變化可計(jì)算得果膠酶活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、1 mL 玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 30mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×2 瓶，4℃保存； 臨用前加入 12.5mL 試劑一 ，50℃加熱溶解，用不完的試劑 4℃保存一周。

試劑三：液體 30mL×1 瓶，4℃避光保存。

酶液提取

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。 10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌、真菌：  按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 提取液）， 冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒， 總時(shí)間 3min）； 然后 10000g，4℃離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3、細(xì)胞培養(yǎng)液等：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作表

酶活性計(jì)算公式

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 3.9642x - 0.008；R² = 0.9996；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，mg/mL；y 為吸光值。

1、按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義： 在 50℃ , pH3.5 條件下，每毫克蛋白每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h/mg prot）= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T 

= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義： 在 50℃ , pH3.5 條件下，每克樣本每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /g 鮮重）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷W

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義： 在 50℃ , pH3.5 條件下，每 10⁴ 細(xì)胞每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /10⁴cell）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷細(xì)胞數(shù)量

4、細(xì)胞培養(yǎng)液

酶活性定義： 在 50℃ ,  pH3.5 條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /mL）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V 反總÷V 樣÷T

=2.523×(ΔA+0.008)

V 反總：反應(yīng)總體積，0.5mL；V 樣：反應(yīng)中樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h

注意事項(xiàng)

1、試劑二若有沉淀析出，請(qǐng)置于50℃加熱溶解。

2、測(cè)定之前請(qǐng)先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果吸光值較高或較低，請(qǐng)用提取液做適當(dāng)?shù)南♂尰蛘呒哟髽?nbsp;本量，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)或者以實(shí)際加入的樣本體積參與計(jì)算。

3、煮沸樣本建議在沸水中煮沸 10 分鐘，以將酶徹底滅活。