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谷胱甘肽還原酶說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-269

正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

GR 是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán) 的關(guān)鍵酶之一（通常昆蟲中 GR 被 TrxR 取代）。GR 催化 NADPH 還原 GSSG 生成 GSH，有 助于維持體內(nèi) GSH/GSSG 比值。GR 在氧化脅迫反應(yīng)中對活性氧清除起關(guān)鍵作用，此外 GR 還參與抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)途徑。

測定原理：

GR 能催化 NADPH 還原 GSSG 再生 GSH，同時 NADPH 脫氫生成 NADP+；NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰，相反 NADP+在該波長無吸收峰；通過測定 340 nm 吸光度下降速率來測 定 NADPH 脫氫速率，從而計算 GR 活性。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、移液器、1mL 石英比色皿和蒸餾水

試劑組成和配置：

試劑一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×2 瓶，-20℃保存。臨用前加入 3 mL 蒸餾水，混勻。

試劑三：粉劑×2 支，-20℃保存。臨用前加入 1.5 mL 蒸餾水，混勻。

粗酶液提?。?/span>

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿。8000g ，4℃離心 15min，取上清，置冰上待測。

2、細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000 ：1  的比例（建 議 500 萬細胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7秒，總時間 3min）；然后 8000g ，4℃, 離心 15min，取上清置于冰上待測。

3、血清等液體：直接測定。

操作步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一置于 25℃（普通物質(zhì)）或者 37℃（哺乳動物）中預(yù)熱 30min。

3、測定管：取 1mL 石英比色皿，依次加入 50μL 試劑三，100μL 試劑二， 750μL 試劑一， 100μL 上清液，混勻，于 340nm 迅速測定初始吸光度和 180  s 吸光度，記為 A 測 1 和 A 測 2 ，△A 測定管= A 測 1﹣A 測 2 。(注意加完上清液后迅速混勻測定)

計算公式：

1、按蛋白濃度計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化 為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷[Cpr×V 樣]÷T 

= 536×△A 測定管÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每克樣本每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/g  鮮重)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 536×△A 測定管÷W

3、按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每 10⁴ 個細胞每分鐘催化 1nmol NADPH 氧 化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/10⁴ cell)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹] ÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T 

= 536×△A 測定管÷細胞數(shù)量

4、按液體體積計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每毫升液體每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化 為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/mL)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷×V 樣÷T 

= 536×△A 測定管

ε：NADPH 摩爾消光系數(shù) 6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)體系總 體積，1000μL=0.001 L；10⁶ ：1 mol=1×10⁶ μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；V 樣： 加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL =0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本 質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，3 min。

注意事項：

1、樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，勻漿液避免反復(fù)凍融；

2、試劑二和試劑三須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制完后，置于冰上，未使用完的 4℃保存，三天內(nèi)使 用完。

3、測定前須先用 1～2 個樣做預(yù)實驗，哺乳動物組織一般須用試劑一稀釋 2～5 倍。

4、細胞中 GR 活性測定時，細胞數(shù)目須在 300 萬-500 萬之間，細胞中 GR 的提取時可加 試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。