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谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶試劑盒說明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-268

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

GST 是一種具有多種生理功能的蛋白質(zhì)家族，主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。GST 是體內(nèi)解毒酶系 統(tǒng)的重要組成部分，主要催化各種化學(xué)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物與 GSH 的巰基共價(jià)結(jié)合，使親電 化合物變?yōu)橛H水物質(zhì)，易于從膽汁或尿液中排泄，達(dá)到將體內(nèi)各種潛在或具備毒性的物質(zhì)降 解并排出體外的目的。因此，GST 在保護(hù)細(xì)胞免受親電子化合物的損傷中發(fā)揮著重要的生 物學(xué)功能。此外，因?yàn)?nbsp;GST 具有 GSH-Px 活性，亦稱為 non-Se GSH-Px ，具有修復(fù)氧化破壞 的大分子如 DNA、蛋白質(zhì)等的功能。

注意：

GST 催化的反應(yīng)減少 GSH 含量，但是不增加 GSSG 含量。

測(cè)定原理：

GST 催化 GSH 與 CDNB 結(jié)合，其結(jié)合產(chǎn)物的光吸收峰波長(zhǎng)為 340nm；通過測(cè)定 340nm 波 長(zhǎng)處吸光度上升速率，即可計(jì)算出 GST 活性。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL 石英比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 45mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加5 mL 蒸餾水溶解。

粗酶液提?。?/span>

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g ，4℃離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000 ：1 的比例（建 議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w ，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g ，4℃, 離心 10min ，取上清置于冰上待測(cè)。

3、血清等液體：直接測(cè)定。

測(cè)定操作：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340 nm ，用蒸餾水調(diào)零。

2、試劑三放在 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動(dòng)物）保溫。

3、測(cè)定管：取 1mL 石英比色皿，加入 100μL 上清液，900μL 試劑二和 100μL 試劑三，迅速 混勻后于 340nm 測(cè)定吸光度變化，記錄 10 s 和 310 s 吸光度為 A1 和 A2。

GST 活性計(jì)算公式：

1、按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol/L CDNB 與 GSH 結(jié)合為 1 個(gè)酶活單位。

GST（nmol/min/mg prot）=(A2－A1))÷ε÷d×10⁹ ×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T 

=230×((A2-A1) ÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每克樣品每分鐘催化 1nmol/L CDNB 與 GSH 結(jié)合為 1 個(gè)酶活單位。

GST（nmol/min/g 鮮重）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹ ×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=230×(A2-A1) ÷W

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1nmol/L CDNB 與 GSH 結(jié)合為 1 個(gè)酶活單位。

GST（nmol/min/10⁴ cell）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹ ×V 反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T 

=230×(A2-A1) ÷細(xì)胞數(shù)量

4、按液體體積計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫升液體每分鐘催化 1nmol/L CDNB 與 GSH 結(jié)合為 1 個(gè)酶活單位。

GST（nmol/min/mL）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹ ×V 反總÷V 樣÷T 

= 230×(A2-A1)

ε：產(chǎn)物摩爾消光系數(shù)，9.6×10³ L/mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm；10⁶ ：1mol=1×10⁶μmol； V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1100μL=0.0011L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）， 需要另 外測(cè)定，建議選用本公司生產(chǎn)的 BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清 液體積，100μL=0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W ，樣本質(zhì)量，g；T ：反應(yīng)時(shí)間 （min），5min。

注意事項(xiàng)：

1、樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力；

2、細(xì)胞中 GST 活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在 300 萬-500 萬之間，細(xì)胞中  GST 的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞；

3、本法測(cè)定 GST 活性的線性范圍可達(dá) 76 μmol/min /L ，測(cè)定前先用 1～2 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如 5min 內(nèi)反應(yīng)不成線性，須對(duì)樣品用蒸餾水稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)；

4、測(cè)定反映的溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響，請(qǐng)控制在 25℃或者 37℃（哺乳動(dòng)物）。