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硫氧還蛋白過氧化物酶活性測定試劑盒說明書(微量法)

貨號：LE-2-267

正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

TPX屬于過氧化物酶家族，在體內(nèi)主要通過還原過氧化氫和一些氫過氧化物來實(shí)現(xiàn)抗氧化作用，功能與GPX類似，也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一。TPX普遍存在于各種生物體內(nèi)，如酵母、植物、動(dòng)物、原生動(dòng)物、寄生蟲、細(xì)菌和古細(xì)菌，在進(jìn)化上高度保守。TPX與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生調(diào)控密切相關(guān)。TPX的主要功能包括細(xì)胞脫毒、抗氧化和調(diào)節(jié)由過氧化氫介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)。

測定原理：

TPX 催化H₂O₂氧化二硫蘇糖醇（DTT），H₂O₂的吸收波長為240nm，通過測定240nm吸光度的下降速率，通過對照減去過氧化氫酶（CAT）催化分解的H₂O₂，即可計(jì)算出TPX活性。因此，本試劑盒可以同時(shí)測定樣品TPX和CAT活性。

自備儀器和用品:

低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、和蒸餾水

試劑組成和配制:

試劑一：液體×1 瓶，室溫保存。

試劑二：液體×1 瓶，-20℃保存。

試劑三：液體×1 支，4℃。

粗酶液提取：

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）； 然后 8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3、血清等液體：直接測定。

TPX 測定操作：

1、分光光度/酶標(biāo)儀計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到240nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一和試劑二置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）水浴預(yù)熱30min。

3、CAT活性測定管：取微量石英比色皿或96孔板，加入4μL上清液，180μL試劑一，16μL試劑三，迅速混勻后于240nm 測定10s和130s吸光度，記為A1和A2。

4、總活性測定管：取取微量石英比色皿或96孔板，加入4μL上清液，180μL試劑二，16μ試劑三，迅速混勻后于240nm 測定10s和130s吸光度，記為A3和A4。

注意：每個(gè)樣品都需要做對照管，以減去過氧化氫酶（CAT ）催化降解的H₂O₂。

TPX 活性計(jì)算公式：

a.  使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1、按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個(gè)酶活單位。

CAT活性（nmol/min/mg prot）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T

=573×(A1－A2)÷Cpr

總活性（nmol/min/mg prot）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T

=573×(A3－A4)÷Cpr

TPX 活性（nmol/min/mg prot）=總活性－CAT 活性

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個(gè)酶活單位。

CAT活性（nmol/min/g）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=573×(A1－A2)÷W

總活性（nmol/min/g）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=573×(A3－A4)÷W

TPX 活性（nmol/min /g）=總活性－CAT 活性

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個(gè)酶活單位。

CAT 活性（nmol/min/10⁴cell）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

=573×(A1－A2)÷細(xì)胞數(shù)量

總活性（nmol/min/10⁴cell）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

=573×(A3－A4)÷細(xì)胞數(shù)量

TPX 活性（nmol/min/10⁴cell）=總活性－CAT 活性

4、按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個(gè)酶活單位。

CAT 活性（nmol/min/mL）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反總÷V 樣÷T

=573×(A1－A2)

總活性（nmol/min/mL）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反總÷V 樣÷T

=573×(A3－A4)

TPX 活性（nmol/min /mL）= 總活性－CAT 活性

ε：H₂O₂的摩爾消光系數(shù)，43600L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10 ^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），4μL=4×10 ^-3 mL；V 樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），2min。

b.  使用96孔板測定的計(jì)算公式如下

1、按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個(gè)酶活單位。

CAT 活性（nmol/min/mg prot）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T

=1146×(A1－A2)÷Cpr

總活性（nmol/min/mg prot）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T

=1146×(A3－A4)÷Cpr

TPX 活性（nmol/min/mg prot）=總活性－CAT 活性

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個(gè)酶活單位。

CAT 活性（nmol/min/g）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=1146×(A1－A2)÷W

總活性（nmol/min/g）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=1146×(A3－A4)÷W

TPX 活性（nmol/min /g）=總活性－CAT 活性

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個(gè)酶活單位。

CAT 活性（nmol/min/10⁴cell）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

=1146×(A1－A2)÷細(xì)胞數(shù)量

總活性（nmol/min/10⁴cell）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

=1146×(A3－A4)÷細(xì)胞數(shù)量

TPX 活性（nmol/min/10⁴cell）=總活性－CAT 活性

4、按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃或者 37℃中，每毫升液體每分鐘催化 1nmol H 2 O 2 降解為 1 個(gè)酶活單位。

CAT 活性（nmol/min /mL）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反總÷V 樣÷T

=1146×(A1－A2)

總活性（nmol/min /mL）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反總÷V 樣÷T

=1146×(A3－A4)

TPX 活性（nmol/min /mL）= 總活性－CAT 活性

ε：H₂O₂的摩爾消光系數(shù)，43600L/mol/cm=0.0436L/μmol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10^-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），4μL=4×10^-3 mL；V 樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），2min。