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脂肪酸合成酶活性試劑盒說明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-138

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

FAS 是脂肪酸合成關(guān)鍵酶，催化乙酰輔酶 A 和丙二酰輔酶 A 而生成長(zhǎng)鏈脂肪酸。FAS 普遍 表達(dá)于各種組織細(xì)胞中，在哺乳動(dòng)物肝、腎、腦、肺和乳腺以及脂肪組織中表達(dá)豐富。

測(cè)定原理：

FAS 催化乙酰 CoA、丙二酰 CoA 和 NADPH 生成長(zhǎng)鏈脂肪酸和 NADP⁺ ；NADPH 在 340nm 有吸收峰，而 NADP⁺ 沒有；通過測(cè)定 340nm  光吸收下降速率，計(jì)算 FAS 活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、 1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 10mL×1 瓶，－20℃保存。用前取出置于 4℃充分解凍后混勻。

試劑二：粉劑×1 瓶 ，4℃保存。臨用前加入 275  μL 試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1 瓶 ，4℃保存。臨用前加入 275  μL 試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：液體 10 mL×1 瓶，4℃保存。

試劑五：粉劑×1 瓶 ，4℃保存。臨用前加入 525  μL 試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

粗酶液提?。?/span>

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。 12000g，4℃離心 40min，取上清置冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）： 試劑一體積（mL）為 500~1000： 1  的比例（建 議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 12000g，4℃,離心 40min， 取上清置于冰上待測(cè)。

3、血清等液體：直接測(cè)定。

FAS 測(cè)定操作：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑四置于 40℃水浴中預(yù)熱 30 min。

3、測(cè)定管：在 1mL 石英比色皿中依次加入 100μL 上清液、20μL 試劑二、20μL 試劑三、820μL 試劑四和 40μL 試劑五，迅速混勻后于 340nm 處測(cè)定吸光值，記錄第30s 和 90s 時(shí)吸光值， 分別記錄為 A1 和 A2 。△A 測(cè)=A1-A2。

FAS 活性計(jì)算公式：

1、按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADPH  為 1 個(gè)酶活單位。

FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V 反總×10⁹) ÷(Cpr×V 樣)÷T 

=1608×△A÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化 1nmol NADPH  為 1 個(gè)酶活單位。

FAS(nmol/min/g  鮮重) = (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹) ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=1608×△A ÷W

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol NADPH  為 1 個(gè)酶活單位。

FAS(nmol /min/10⁴ cell) = (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹) ÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

= 1608×△A ÷細(xì)胞數(shù)量

4、按液體體積計(jì)算

活性單位定義：37℃中每毫升樣本每分鐘氧化 1nmol NADPH  為 1 個(gè)酶活單位。

FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V 反總×10⁹) ÷V 樣÷T

=1608×△A

ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³/mol/cm； d：比色皿光徑， 1 cm；V 反總：反應(yīng)體系總 體積， 1000μL=0.001 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；V 樣：加入 反應(yīng)體系中上清液體積， 100μL=0.1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間， 1min。