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谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性測(cè)定試劑盒說明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-192

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

GPT（EC 2.6. 1.2）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化氨基酸和酮酸轉(zhuǎn)氨 基反應(yīng)，在氨基酸代謝中具有重要作用。此外，哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞 GPT 活性很高，當(dāng)肝細(xì)胞 壞死，GPT 釋放到血液中，血清 GPT 活性顯著增高。因此，GPT 被世界衛(wèi)生組織推薦為肝 功能損害最敏感的檢測(cè)指標(biāo)。

測(cè)定原理

GPT 催化丙氨酸和α-酮戊二酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，生成丙酮酸和谷氨酸；加入 2,4-二硝基苯肼 溶液，不僅終止上述反應(yīng)，而且與酮酸中的羰基加成，生成丙酮酸苯腙；苯腙在堿性條件下 呈紅棕色，可以在 505nm 讀取吸光值并計(jì)算酶活力。

試驗(yàn)中所需的儀器和用品

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸 餾水。

試劑的組成和配制

提取液：30mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 5 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 6 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：液體 60 mL×1 瓶，4℃保存；

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提 取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作表：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 505nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、 在 EP 管中加入下列試劑

混勻后，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）準(zhǔn)確反應(yīng) 20min

混勻后，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）準(zhǔn)確水浴 20min

混勻，室溫放置 10min ，在 505nm 波長(zhǎng)處，測(cè)各管吸光度 A 。 ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。 每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

注意：

血清(漿)等樣本煮沸過程中可能出現(xiàn)果凍狀沉淀，可取消煮沸步驟，直接加入未煮沸 的 10μL 樣本。

計(jì)算方式

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸曲線，y = 0.4228x+0.0003 (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，umol/mL；y 為 ΔA)。

2、血清（漿）GPT 活力的計(jì)算

單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GPT（nmol/min/mL）=  (ΔA-0.0003）÷0.4228÷T×103= 118.26×  (ΔA-0.0003）

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中GPT 活力的計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GPT（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ 

= 118.26×(ΔA-0.0003） ÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GPT（nmol/min/g 鮮重）=[(ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³ 

= 118.26× (ΔA-0.0003）÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。 GPT（nmol/min/10⁴ cell）=[(ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×10³ 

=0.236×(ΔA-0.0003）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V2：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，20min； Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)；103：1umol/mL= 103   nmol/mL。

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為：0.01 umol/mL -2 umol/mL。

2、ΔA 線性范圍為：0.01 -2。