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正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

Pro 廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，逆境條件下，植物體內(nèi)Pro 含量顯著增  加。Pro 增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸。因此， 脯氨酸增加量可以作為抗逆育種的生理指標(biāo)之一。

測(cè)定原理：

用磺基水楊酸（SA）提取 Pro，加熱處理后，Pro 與酸性茚三酮溶液反應(yīng)生成紅色；加甲苯 萃取后，在 520nm 測(cè)定吸光度。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、 1 mL 玻璃比色皿、冰乙酸 50mL、甲苯 50mL、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：冰乙酸 25 mL×1 瓶，4℃保存。（自備）

試劑二：液體 25 mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：甲苯 50mL×1 瓶，4℃保存。（自備）

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：

1 、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液）， 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s， 間隔 10s，重復(fù) 30 次）；之后  置 90℃振蕩提取 10min； 10000g，25℃離心 10min， 取上清，冷卻后待測(cè)。

組織： 按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加 入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿； 之后置 90℃振蕩提取 10min； 10000g，25℃離心 10min， 取上清，冷卻后待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建  議取 0.1mL 血清（漿）加入 1mL 提取液），充分混勻，之后置 90℃振蕩提取 10 分鐘，10000g， 25℃離心 10 分鐘，取上清，冷卻后待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 520nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定：

（1）取 0.5mL 樣本+0.5mL 試劑一+0.5mL 試劑二 于有蓋試管中，置沸水浴中保溫 30min（蓋 緊，防止水分散失），每 10min 振蕩一次。

（2）待冷卻后，在試管中加入 1mL 試劑三，振蕩 30s ，靜置片刻，使色素轉(zhuǎn)至試劑三中； 吸取 0.8mL-1mL 上層溶液于 1mL 玻璃比色皿中，于 520nm 波長(zhǎng)處比色，記錄吸光值 A。

Pro 含量計(jì)算：

1、典型回歸方程 y = 0.0521x - 0.0021  (x 為脯氨酸含量，μg/mL；y 為吸光值 A)

2、按照血清（漿）體積計(jì)算

Pro 含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2）

=192×(A+0.0021)

3、按照蛋白濃度計(jì)算

Pro 含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)

=19.2×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

Pro 含量(μg/g 鮮重)= [(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)

=19.2×(A+0.0021) ÷W

5、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

Pro 含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)

=0.0384×(A+0.0021)

V1 ：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.5mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿） 體積 ，0.1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500 ：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)， 500 萬(wàn)。

注意：最低檢測(cè)限為 1μg/mL 或 1μg/g 鮮重或 0.01μg/mg prot