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抗壞血酸氧化酶（AAO）活性測定試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-276

正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

AAO 是定位于植物細胞壁的糖蛋白，屬“藍銅氧化酶”家族。細胞壁內(nèi)的抗壞血酸和AAO 與細胞壁的代謝和生長有著密切的聯(lián)系。AAO  氧化 AsA  所形成的 MDHA  可通過質(zhì)膜上 的細胞色素 b 還原，該過程中電子的跨膜運輸能夠促進細胞生長。

測定原理：

AAO 可直接氧化 AsA，通過測定 AsA 的氧化量，可計算得 AAO 活力。

實驗中所需儀器及設備：

低溫離心機、紫外分光光度計、 1mL石英比色皿、可調(diào)式移液器、研缽、冰、 蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 60mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×2 瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿。16000g ，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

AAO 測定操作：

1、 分光光度計預熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 265 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑二在 25℃水浴鍋中預熱 30 min。

3、 取 1 瓶試劑三，加入 2mL 蒸餾水充分溶解；配好的試劑三 3 天內(nèi)用完。

4、 工作液的配制：將試劑二與試劑三按 17(mL）:1(mL)的比例混合，用多少配多少。

5、 依次在 1 mL 石英比色皿中加入 100μL 上清液和 900μL 工作液，迅速混勻后在 265nm 測 定 10 s 和 130 s 光吸收 A1 和 A2 ，△A =A1-A2。

AAO 活性計算公式：

1、按蛋白濃度計算

AAO 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。

AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反總×10⁹÷(Cpr×V 樣)÷T 

= 92.4×△A÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計算

AAO 活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。

AAO(nmol/min/g 鮮重) = △A÷(ε×d）×V 反總×10⁹÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T 

= 92.4×△A÷W

ε：AsA 在 265nm 處摩爾吸光系數(shù)為 5.42×10⁴  L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1 cm；V 反 總：反應體系總體積（L），1000μL=1×10^-3   L；10⁶ ：1mol=1×10⁹ nmol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；V 樣：加入反應體系中上清液體積（mL），100μL=0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣 本質(zhì)量，g；T：催化反應時間（min），2min。