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脫氫酶(DHA) 試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-379

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

脫氫酶(dehydrogenase, DHA) 是一類催化物質(zhì)氧化還原反應(yīng)的酶，催化底物通過細(xì)胞色素系統(tǒng)被氧化，釋放的能量供機體使用，是生物體取得能量的一種方式。

測定原理：

在細(xì)胞呼吸過程中，氫受體 2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC）在脫氫酶作用下接受氫以后，被還原為三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone, TF），TF 呈現(xiàn)紅色，在波長 485nm 處有最大吸收峰，采用分光光度法于 485nm 測定其吸光值，即得脫氫酶活性。

試劑的組成和配制：

提取液：液體50ml×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶，使用前加 10ml 試劑二溶解，4℃避光保存（盡量現(xiàn)配現(xiàn)用）。

試劑二：液體20ml×1瓶，4℃保存。

試劑三：甲醇（自備）。

需自備儀器和用品：

篩子、天平、恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋、低溫離心機、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、冰 、蒸餾水 、甲醇（不允許快遞，請用戶自備）。

樣品處理：

1 、細(xì)菌 、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（ 10⁴ 個）：提取液體積（ml）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)  胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 8000g， 4℃,  離心 10min，取上清置于冰上待測。

2 、組織 ：按照組織質(zhì)量（ g） ：提取液體積(ml)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1ml 提取液）進行冰浴勻漿，然后 8000g，4℃,   離心 20min。

3 、液體 ：直接檢測。

測定步驟：

充分混勻，37℃培養(yǎng) 24h

振蕩 1h，8000g，25℃,   離心 5min，取 1ml 上清于比色皿，測定 A485，△A=A 測定-A 空白管 。空白 管只要做一管。

脫氫酶活力計算：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0422x - 0.0312；R² = 0.9988；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度   ( μg/ml） ，y 為吸光值。

1、按照蛋白濃度計算

酶活單位定義：在 37℃時，每 mg 蛋白樣品每min 催化產(chǎn)生 1μgTF 為一個酶活性單位。

DHA ( μg/ min / mg prot）= (△A+0.0312）÷ 0.0422×V 反總÷（ Cpr×V 樣）÷T

= 0.181× (△A+0.0312） ÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：在 37℃時，每克樣品每min 催化產(chǎn)生 1μgTF 為一個酶活性單位。

DHA ( μg/ min /g  鮮重）=(△A+0.0312）÷ 0.0422×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

= 0.181× (△A+0.0312） ÷W

3、按液體體積計算

酶活單位定義：在 37℃時，每 ml 樣本每min 催化產(chǎn)生 1μgTF 為一個酶活性單位。

DHA ( μg/ min /ml）= (△A+0.0312）÷ 0.0422×V 反總÷V 樣÷T

= 0.181× (△A+0.0312）

V 反總：反應(yīng)總體積，1.65ml；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0. 15ml；T：培養(yǎng)時間，1d= 1440min； W：樣品質(zhì)量，g； Cpr：蛋白濃度，mg/ml。

注意事項：

配制好的試劑一避光保存于 4℃, 最好在一周內(nèi)使用，若出現(xiàn)紅色，則不能使用。