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NAD 激酶（NAD kinase, NADK）試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-343

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

NADK（EC 2.7.1.23 ）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中 ，是目前所發(fā)現(xiàn)的生物 體內惟一能夠催化 NAD⁺ 磷酸化生成 NADP⁺ 的酶，可催化 NAD(H)以ATP 或無機多聚磷酸 [poly(P)]作為磷?；w進行磷酸化反應，生成 NADP(H)。因此，NAD 激酶在合成 NADP(H) 以及調節(jié) NAD(H)與 NADP(H)的平衡上具有重要作用。

測定原理：

NADK 催化 NAD⁺ 磷酸化，生成 NADP⁺ ；NADP⁺ 可被 6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為 NADPH；在 340 nm下測定 NADPH 增加速率?？煞从吵?/span> NADK 活性的大小。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、 1 mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 25 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1 瓶，-20 ℃保存；

試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃保存；

樣本測定的準備：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液）， 進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟

1、分光光度計預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調零。

2、將試劑一和試劑二 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 15min 以上。

3、工作液Ⅰ的配制：在試劑三中加入 12mL 試劑一，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃ 保存，禁止反復凍融；

工作液Ⅱ的配制：在試劑四中加入 45mL  試劑二，充分混勻待用； 用不完的試劑分裝后 -20℃保存，禁止反復凍融；

4、加樣表

充分混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 15min，立即煮沸  2min（蓋緊，防止水分散失）冰浴冷卻， 10000g，25℃離心 10min，取上清

加完試劑混勻，室溫靜置 15min，340nm 下測定吸光值，ΔA=A 測定-A 對照。

NADK 活性計算：

1、血清（漿）NADK 活力的計算:

單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘生成 1 nmol 的 NADP 定義為一個酶活力單位。 

NADK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T

=53.59×ΔA

2、組織、細菌或細胞中 NADK 活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADP 定義為一個酶活力單位。

NADK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=53.59×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADP 定義為一個酶活力單位。

NADK（nmol/min /g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=53.59×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol NADP 定義為一個酶活力單位。

NADK（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=0.107×ΔA

V 反總：反應體系總體積，5×10^-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm； d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL；T： 反應時間， 15  min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g； 500：細菌或細胞 總數(shù)，500 萬。