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土壤堿性磷酸酶（S-AKP/ALP）活性測(cè)定試劑盒說明書（可見分光光度法）

測(cè)定意義：

土壤磷酸酶是一類催化土壤有機(jī)磷化合物礦化的酶，其活性的高低直接影響著土壤中有機(jī)磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性，是評(píng)價(jià)土壤磷素生物轉(zhuǎn)化方向與強(qiáng)度的指標(biāo)。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和 pH 顯著影響。通常按照其最適 pH 范圍，分為堿性、中性和酸性三種類型磷酸酶。

堿性環(huán)境中，S-AKP/ALP 催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉，通過測(cè)定酚的生成量即可計(jì)算出 S-AKP/ALP 活性。

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。用前加 50mL 蒸餾水充分溶解。試劑三：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加 1152μL 無水乙醇（自備），48 μL 蒸餾水充分溶解。（變褐色后不能再使用）

標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1mL×1 支，0.5μmol/mL 苯酚標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：

可見分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿、臺(tái)式離心機(jī)、37℃恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、冰、蒸餾水、乙醇和甲苯（不允許快遞）。

操作步驟：

催化反應(yīng)：

稱取風(fēng)干混勻土壤約 0.1g，加入 0.05mL 甲苯（自備），輕搖 15min；加 0.4 mL 試劑一并且搖勻后，置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱，開始計(jì)時(shí)，催化反應(yīng) 24h；到時(shí)后迅速加入 1mL 試劑二充分混勻，以終止酶催化的反應(yīng)。10000rpm 室溫離心 10min，取上清液置于冰上待測(cè)。

顯色反應(yīng)：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 660 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 50 μL 試劑一，100 μL 試劑三，20 μL 試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水 830 μL，混勻后室溫靜置 30 min，于 660 nm 測(cè)定吸光度，記為 A 空白管。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 50 μL 標(biāo)準(zhǔn)液，100 μL 試劑三，20 μL 試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水 830 μL，混勻后室溫靜置 30 min，于 660 nm 測(cè)定吸光度，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測(cè)定管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 50 μL 上清液，100 μL 試劑三，20 μL 試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水 830 μL，混勻后室溫靜置 30 min，于 660 nm 測(cè)定吸光度，記為 A 測(cè)定管。

S-ALP 活性計(jì)算：

活性單位定義：37℃中每克土壤每天釋放 1μmol 酚。

S-AKP/ALP（U/g 土樣）=[C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]×V 總÷W÷T×1000

= 725×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)液：0.5μmol/L；V 總：催化體系總體積，1.45mL；W：土壤樣品質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時(shí)間，24 h=1 d。