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過(guò)氧化物酶試劑盒說(shuō)明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-160

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

POD（EC 1. 11. 1.7）廣泛存在于動(dòng)物 、植物 、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，可催化過(guò)氧化氫氧化酚類和胺類 化合物，具有消除過(guò)氧化氫和酚類 、胺類毒性的雙重作用。

測(cè)定原理：

POD 催化 H2O2 氧化特定底物，在 470nm 有特征光吸收。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 100μl×1 瓶，4℃保存；

試劑三：液體 100μl×1 瓶，4℃保存。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì) 、 臺(tái)式離心機(jī) 、可調(diào)式移液器 、 1 ml 玻璃比色皿 、研缽 、冰和蒸餾水。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌 、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（ 10⁴ 個(gè)）：

提取液體積（ml）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或 細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰 上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（ g） ：提取液體積(ml)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1ml 提 取液） ，進(jìn)行冰浴勻漿 。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟和加樣表：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 470nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液的配制：臨用前將試劑一 、試劑二 、試劑三按照 2.6（ml）： 1.5  ( μl）： 1  ( μl） 的比例混勻； 在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）預(yù)熱 10min 以上；現(xiàn)配現(xiàn)用。

3、在 1ml 玻璃比色皿中加入 50μl 樣本和 950μl 工作液，混勻，記錄 470nm 下 1min 時(shí)吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2 。計(jì)算ΔA＝A2-A1。

注意：

如果ΔA 小于 0.005，可將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到 5min 。如果ΔA 大于 0.5 ，可將樣本用提取液稀釋后測(cè)定，計(jì)算 公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

POD 活性計(jì)算：

1、血清（漿）POD 活性

單位定義：每 ml 血清（漿）在每ml 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。 

POD（U/ml）=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.01÷T

=2000×ΔA

2、組織 、細(xì)菌或細(xì)胞POD 活性

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每 mg 組織蛋白在每ml 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。 

POD（U/mg prot） =ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T

=2000×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每 g 組織在每ml 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。 

POD（U/g  鮮重） =ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T

=2000×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每ml 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。 

POD（U/10⁴ cell） =ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T

=4×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1ml； V 樣：加入樣本體積，0.05ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反 應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。