產(chǎn)品名稱：NADP磷酸酶(NADPase)測(cè)試盒
產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣,100管/96樣
產(chǎn)品貨號(hào)：LE-1-344,LE-2-344
產(chǎn)品報(bào)價(jià)：
免費(fèi)咨詢：0551-66107970
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貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
檢測(cè)方法 |
規(guī)格 |
售價(jià)（元） |
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LE-1-344 |
NADP磷酸酶(NADPase)測(cè)試盒 |
分光光度法 |
50管/48樣 |
520 |
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LE-2-344 |
NADP磷酸酶(NADPase)測(cè)試盒 |
微量法 |
100管/96樣 |
980 |
NADP 磷酸酶（NADPase）試劑盒說明書(分光光度法)
貨號(hào)：LE-1-344
正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
NADPase 主要存在于植物組織中，是生物體內(nèi)唯一催化 NADP+降解為 NAD+的酶，與 NADK 一起調(diào) 控 NAD 和 NADP 之間的平衡。
測(cè)定原理：
NADPase 能夠催化 NADP+水解為 NAD+和無(wú)機(jī)磷的反應(yīng)，通過測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量來測(cè)定 NADPase 活性。
試劑的組成和配制：
提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 30 mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×5 支，-20℃保存；用時(shí)每支加入 1 ml 試劑一充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存， 禁止反復(fù)凍融。
試劑三：粉劑×1 瓶, 4℃保存 。用時(shí)加入 25ml 蒸餾水，溶解后 4℃可保存一周。
試劑四：粉劑×1 瓶, 4℃保存 。用時(shí)加入 25ml 蒸餾水，溶解后 4℃可保存一周。
試劑五：液體 25mL×1 瓶，室溫保存。
試劑六：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10ml×1 瓶 ，4℃保存。
0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑六 20 倍稀釋，即取 0.5ml 試劑六加 9.5 蒸餾水，充分混勻。
定磷試劑的配制：按 H2O: 試劑三:試劑四:試劑五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色，若無(wú) 色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意：配試劑最好用新的燒杯 、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
自備儀器和用品：
可見分光光度計(jì) 、恒溫水浴鍋 、 臺(tái)式離心機(jī) 、可調(diào)式移液器 、 1 ml 玻璃比色皿 、研缽 、冰和蒸餾水
樣本的前處理：
按照組織質(zhì)量（ g）：提取液體積(ml)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1ml 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿 。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、酶促反應(yīng)
試劑名稱 ( μl）
測(cè)定管
對(duì)照管
試劑一
300
300
試劑二
100
100
樣本
100
蒸餾水
100
2、定磷
標(biāo)準(zhǔn)管
空白管
測(cè)定管
對(duì)照管
0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液
100
蒸餾水
100
上清液
100
100
定磷試劑
1000
1000
1000
1000
注意事項(xiàng)：
1、此法具有微量 、靈敏 、快速的特點(diǎn) 。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格，要沒有一點(diǎn)磷，若試管放過磷酸 或磷酸鹽緩沖液，一定要洗得非常干凈，要先用洗潔精加水煮，再用自來水沖，最后用蒸餾水沖干凈。最好用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是檢測(cè)成敗的關(guān)鍵。
2、標(biāo)準(zhǔn)管 、空白管和對(duì)照管只要做一次即可。
NADPase 酶活性計(jì)算：
1、按組織蛋白濃度計(jì)算：
定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白 NADPase 分解 NADP 產(chǎn)生 1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè) NADPase 活力單位。
NADPase (μmol/h/mg prot)=(C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總)×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷ (V 樣×Cpr)÷T
=5×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷Cpr
2、按樣本鮮重計(jì)算：
定義：每小時(shí)每 g 組織 NADPase 分解 NADP 產(chǎn)生 1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè) NADPase 活力單位。
NADPase (μmol/h/g 鮮重)=(C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總)×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）× V 總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T
=5×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷W
C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/ml；V 總：酶促反應(yīng)總體積，0.5ml；V 樣：加入樣本體積，0. 1ml ；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5 小時(shí)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本鮮重，g。
37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）預(yù)熱 5min
37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）準(zhǔn)確反應(yīng) 30min 后，95℃水浴 5min（蓋緊， 以防止水分散失）， 冷卻后，10000g 25℃離心 5min，取上清
混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 30min，冷卻至室溫，在 660nm 處 ，蒸餾水調(diào)零，記 錄各管吸光值。
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