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酪氨酸解氨酶試劑盒說(shuō)明書(shū)(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-180

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

TAL 廣泛存在于植物和微生物中，是苯丙氨酸代謝途徑的關(guān)鍵酶之一。TAL 能夠躍過(guò)肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）直接將酪氨酸轉(zhuǎn)化為香豆酸，香豆酸可進(jìn)一步生成白藜蘆醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素類(lèi)天然產(chǎn)物。

測(cè)定原理：

TAL 能夠分解酪氨酸產(chǎn)生香豆酸，使反應(yīng)溶液 333nm 下的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間而上升，根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出TAL 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×2 瓶，4℃保存；

試劑三：液體 5mL×1 瓶，4℃保存；

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）果汁等液體樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 333nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑二的配置：臨用前在試劑二瓶中加入 15mL 試劑一充分溶解待用（用不完的試劑 4℃ 保存一周，注意現(xiàn)配現(xiàn)用），在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。

3、在EP 管中依次加入如下試劑

混勻，10000g4℃離心 5min，取 0.8~1mL 上清至 1mL 石英比色皿，333nm 下測(cè)定吸光值 A測(cè)定與A 對(duì)照，ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照

TAL 活性計(jì)算：

1、血清（漿）或果汁 TAL 活性

單位的定義：每分鐘每 mL 血清（漿）或果汁在每 mL 反應(yīng)體系中使 333nm 處吸光值變化0.01 為一個(gè)酶活力單位。

TAL（U/mL）=ΔA×V 反總÷( V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T

=17.5×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 TAL 活性

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中使 333nm 處吸光值變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。

TAL（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr ）÷0.01÷T

=17.5×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每分鐘每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中使 333nm 處吸光值變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。

TAL（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T

=17.5×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每 mL 反應(yīng)體系中使 333nm 處吸光值變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。

TAL（U/10⁴ cell）=ΔA×V 反總÷( 500×V 樣÷V  樣總)÷0.01÷T

=0.035×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.05mL；V 樣：加入樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，60 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500： 細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。