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抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定試劑盒說明書(分光光度法) 

貨號：LE-1-277

正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗壞血酸代謝的關(guān)鍵酶之一。APX 具有 多種同功酶，分別定位于葉綠體、胞質(zhì)、線粒體、過氧化物和乙醛酸體，以及過氧化體和類 囊體膜上。APX  催化 H2O2 氧化 AsA ，是植物 AsA  的主要消耗者。APX 的活性直接影響到 AsA 的含量，APX 與 AsA 具有一定的負(fù)相關(guān)性。

測定原理：

APX 催化催化 H2O2 氧化 AsA ，通過測定 AsA 氧化速率，來計算得 APX 活性。

自備儀器用品：

低溫離心機(jī)、紫外分光光度計、1mL 石英比色皿、移液槍、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 90mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×2 瓶，4℃保存。臨用前加 2.5 mL 蒸餾水充分溶解（溶解后 4℃保存，3 天內(nèi) 用完）。

試劑三：液體 5mL×1 支，4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。13000g ，4℃離心 20min ，取上清置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30 min ，調(diào)節(jié)波長到 290nm ，用蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一在 25℃中預(yù)熱 30min。

3、依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 上清液、700μL 預(yù)熱的試劑一、100μL 試劑二和 100μL 試劑三，迅速混勻后在 290nm 測定 10 s 和 130 s 光吸收 A1 和 A2 ，△A=A1-A2。

APX 活性計算公式：

1、按樣本蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d） ×V 反總×10⁹÷(Cpr×V 樣)÷T

= 1786×△A÷ Cpr

2、按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每 g 組織每分鐘氧化 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。

APX(nmol/min/g 鮮重 ) = △A÷(ε×d） ×V 反總×10⁹÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T 

= 1786×△A ÷W

ε ：AsA 在 290nm 處摩爾吸光系數(shù)為 2.8×10³ L/mol/cm；d： 比色皿光徑（cm），1 cm；V 反 總：反應(yīng)體系總體積（L），1000μL= 1×10^-3 L；10⁹ ：1mol= 1×10⁹nmol；V 樣：加入反應(yīng)體系 中上清液體積（mL），100μL=0. 1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；W：樣本 質(zhì)量，g；T ：催化反應(yīng)時間（min），2min。