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海藻糖含量測試盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-221

正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存；

標準品：粉劑×1 支，含 10mg 海藻糖。

產(chǎn)品說明：

海藻糖存在于大量有機體中，包括細菌、藻類、酵母、植物、昆蟲和其他無脊椎動物。由于海藻糖具有獨特的不同于其他碳水化合物的生物學特性，能在干旱、高溫、脫水、冷凍、高滲透壓及毒性物質(zhì)等惡劣環(huán)境下保護生物體細胞蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、核酸等組分不受損害。

測定原理：

測定方法采用蒽酮比色法。具有靈敏度高﹑簡便快捷﹑適用于微量樣品的測定等優(yōu)點。但是蒽酮比色法也存在一定缺陷，如果樣本中含有可溶性糖，則會影響測定。本試劑盒建議用于除海藻糖外不含其他可溶性糖樣本的測定。

試驗中所需的儀器和試劑：

可見分光光度計、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿﹑研缽、濃硫酸和蒸餾水。

操作步驟：

一、海藻糖提取：

1、細菌或細胞處理：收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率 20％，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復 30 次），室溫靜置 45min，振蕩 3~5 次，冷卻后，8000g，常溫離心，取上清。

2、組織的處理：稱取約 0.1g 樣本，常溫研碎，加入 1mL 提取液，室溫靜置 45min，振蕩 3~5 次， 冷卻后，8000g，常溫離心，取上清。

3、血清（漿）的處理：吸取約 100μL 血清（漿），加入 0.9mL 提取液，室溫靜置 45min，振蕩 3~5次，冷卻后，8000g，常溫離心，取上清。

4、標準品的處理：標準品用 1mL 雙蒸水溶解，溶液濃度為 10mg/mL，稀釋到 0.1、0.08、0.06、0.04、0.02、0mg/mL。

二、測定操作表：

1、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 620nm，蒸餾水調(diào)零。

2、調(diào)節(jié)水浴鍋至 95 度。

3、工作液的配制：臨用前在每瓶試劑一中加入 16mL 蒸餾水后，緩慢加入 64mL 濃硫酸，不斷攪拌， 充分溶解，待用。用不完的試劑 4℃保存一周。

4、標準曲線的建立：取 0.25mL 標準液和 1mL 工作液至 EP 管中，95 度水浴 10min（蓋緊，防止水分散失），自然冷卻至室溫，取 1mL 至比色皿中，在 620nm 處測吸光值 A。根據(jù)標準樣本的濃度（y）和吸光度（x）建立標準曲線。

5、樣本測定：取 0.25mL 樣本和 1mL 工作液至 EP 管中，95 度水浴 10min（蓋緊，防止水分散失）， 自然冷卻至室溫，取 1mL 至比色皿中，在 620nm 處測吸光值 A。

注意：若吸光值大于 1，請將樣本用提取液稀釋后再測定，計算公式中乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

三、海藻糖含量計算：

1、根據(jù)標準曲線計算樣本中海藻糖的含量 y（mg/mL）。

2、按樣本鮮重計算：

海藻糖含量(mg/g 鮮重)= V1×y÷(W×V1÷V2)=y ÷W。

3、按樣本蛋白濃度計算：

海藻糖含量(mg/mg prot)=V1×y÷(V1×Cpr)=y÷Cpr。

4、按細菌或細胞數(shù)量計算：

海藻糖含量(μg/10⁴ cell)=（1000 × V1 × y）÷(500 × V1÷V2)=2× y

5、按血清（漿）體積含量計算

海藻糖含量（mg/mL）＝(V1×y)÷(V3×V1÷V2)=10×y

1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25 mL；V2：提取液總體積，1mL； V3：加入血清（漿）體積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。