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貨號：LE-1-216

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，是三羧酸循 環(huán)第一個限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點之一。

測定原理：

CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶 A，進一步水解產(chǎn)生檸檬酸；該反應(yīng)促使無色 的 DTNB 轉(zhuǎn)變成黃色的 TNB，在  412nm 處有特征吸光值。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、 水浴鍋、可調(diào)式移液器、 1mL  玻璃比色皿、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水

試劑組成和配制：

試劑一： 液體 25mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二： 液體 5mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三： 液體 0.5mL×1 支 ，-20℃保存；

試劑四： 液體 28mL×1 瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存， 臨用前加入 1.2mL 蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①   稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL  試劑三 ，用冰浴勻漿器 或研缽勻漿。

②   將勻漿 600g，4℃離心 5min。

③   棄沉淀，將上清液移至另一離心管中， 11000g，4℃離心 10min。

④   上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的 CS（此步可選做）。

⑤   在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL  試劑三 ，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體 CS 測定。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

①   在試劑五中加入 0.6mL 無水乙醇和 13mL 試劑四，混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其 它物種）孵育 5min； 用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

②   測定管：在 EP 管中加入 40μL 樣本、880μL 試劑五和 40μL 試劑六，混勻，37℃反 應(yīng) 15min 后立即測定吸光值 A1。

③   對照管：在 EP 管中加入 40μL 樣本、880μL 試劑四和 40μL 試劑六，混勻，37℃反 應(yīng) 15min 后立即測定吸光值 A2。

④   計算 ΔA=A1-A2，每個測定管設(shè)一個對照管。

CS 活性計算：

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。  

CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

= 117.6×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。

CS（nmol/min /g  鮮重）=[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T

=23.8×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。

CS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T

=0.0475×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，9.6×10^-4 L；ε：TNB 摩爾消光系數(shù)， 1.36×10⁴ L / mol /cm；d： 比  色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.04 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T： 反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。