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過氧化氫酶試劑盒說明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-159

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是最主要的 H₂O₂ 清除酶，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。

測定原理：

H₂O₂ 在 240nm 下有特征吸收峰，CAT 能夠分解H₂O₂ ，使反應(yīng)溶液 240nm 下的吸光度隨反 應(yīng)時(shí)間而下降，根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出CAT 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存； 

工作液：60mL×1 瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000 ：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提 取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 240nm 處，蒸餾水調(diào)零。

2、測定前將 CAT 檢測工作液37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min。

3 、在 1mL 石英比色皿中加入 35μL 樣本和 1mL 工作液，混勻，室溫下立即測定 240nm 下 的初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A1-A2

注意事項(xiàng)：出現(xiàn)負(fù)值怎么辦？

檢查反應(yīng)過程是否產(chǎn)生氣泡，氣泡多說明酶活性太高，氣泡影響產(chǎn)生了負(fù)值，可以將樣 本用提取液稀釋 10 倍后再檢測。如果稀釋樣本或反應(yīng)體系沒有產(chǎn)生氣泡仍然出現(xiàn)較小的負(fù) 值，說明該樣本測不到該酶活。

CAT 活性計(jì)算：

1、血清（漿）CAT 活力的計(jì)算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化 1nmol H₂O₂ 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

 CAT(nmol/min/mL)= [ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T

=678×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 CAT 活力計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化 1nmol H₂O₂  降解定義為一個(gè)酶活力單位。 

CAT(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=678×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化 1nmol H₂O₂  降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(nmol/min /g  鮮重)=[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T

=678×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化 1nmol H₂O₂ 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(nmol/min /10⁴ cell) ＝[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T

= 1.356×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.035×10^-3  L；ε：H₂O₂ 摩爾消光系數(shù)，4.36×10⁴ L / mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.035 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總 數(shù)，500 萬。