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?；D(zhuǎn)移酶活性測定試劑盒說明書(分光光度法-25T)

貨號：LE-2-142

正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

AAT 是一個多功能蛋白大家族，主要負責催化生物體內(nèi)各種酰基化和去?；磻诨虮磉_、代謝和信號傳導中具有重要作用。

測定原理：

AAT 催化乙酰 CoA 轉(zhuǎn)移乙?；蕉〈迹尫诺?CoA 還原 DTNB 生成TNB；TNB 在 412nm 有吸收峰，測定 412 nm吸光度增加速率可計算 AAT 活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺式離心機、可見分光光度計、 1mL 玻璃比色皿、恒溫水浴鍋、無水乙醇。

試劑組成和配制：

提取液：液體 25mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 25mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存。

試劑三：粉劑×1支，4℃避光保存。

粗酶液提?。?/span>

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液）進行冰浴勻漿。 8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

2、細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴ 個）： 提取液體積（mL）為 500~1000： 1  的比例（建 議 500 萬細胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 8000g，4℃,離心 10min， 取上清置于冰上待測。

3、液體：直接檢測。

AAT 測定操作：

1、 分光光度計預熱 30min，調(diào)節(jié)波長到 412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 工作液的配制：臨用前在試劑二瓶中加入 22.5mL 試劑一，充分混勻待用。 用不完的試 劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

3、 試劑三的配制： 臨用前加無水乙醇 1.25mL 充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存。

4、 空白管：在 Ep 管或 96 孔板中加入 50μL 提取液和 900μL 工作液，充分混勻，35℃反應 15min，加入 50μL 試劑三，充分混勻，25℃靜置 10min，測定 412nm 處吸光值，記為 A 空 白管。

5、 測定管： 在 Ep 管或 96 孔板中加入 50μL 樣本和 900μL 工作液，充分混勻，35℃反應 15min，加入 50μL 試劑三，充分混勻，25℃靜置 10min，測定 412nm 處吸光值，記為 A 測 定管。△A=A 測定管- A 空白管，空白管只要做一管。

AAT 活性計算公式：

1、按照蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min /mg prot) = △ A ÷ (ε ×d）×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T

= 98.04×△ A÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min /g  鮮重) = △ A ÷ (ε ×d）×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T

= 98.04×△ A÷W 

3、按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：每 10⁴ 個細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 定義為一個酶活單位。 AAT (nmol/min /10⁴ cell) = △ A ÷ (ε ×d）×V 反總÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總) ÷T

= 98.04×△ A÷ 細胞數(shù)量

4、按液體體積計算

活性單位定義：每毫升樣品每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 定義為一個酶活單位。 

AAT (nmol/min /mL) = △ A ÷ (ε ×d）×V 反總÷V 樣÷T

=98.04×△ A

ε ：TNB 消光系數(shù)， 13600L/mol/cm；V 反總：反應總體積， 1mL；V 樣：加入反應體系中 上清液體積，0.05mL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL； Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：樣 本質(zhì)量，g；T：反應時間， 15 min。