自拍偷自拍亚洲精品第|精品无码一级黄色视频|国产亚洲一区二区不卡片|色综合天天综合网国产人|天码精品专区一区二区三区|日韩免费无码专区精品观看|国产女主播精品大秀系列在线|国产欧美一区二区三区另类精品

線粒體異檸檬酸脫氫酶（ICDHm）活性測定試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-215

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

ICDHm（EC 1.1.1.41）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，在三羧酸循中催化異檸檬酸生成 α-酮戊二酸，同時(shí)將 NAD⁺ 還原為 NADH，是三羧酸循環(huán)的限速酶之一，其催化的反應(yīng)是細(xì)胞 NADH 主要來源之一。

測定原理

ICDHm 催化異檸檬酸和NAD⁺ 生成α-酮戊二酸和 NADH ，NADH 在 340nm 下有特征吸收峰，通過檢測 340nm 處光吸收上升速率來反映 ICDHm 活性的高低。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸 餾水。

試劑的組成和配制

試劑一：50mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二：10mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：1mL×1 支，-20℃保存；

試劑四：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1支， 4℃保存；

試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；

試劑七：粉劑×1支， -20℃保存;  臨用前加入 3mL 蒸餾水充分混勻待用；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

工作液的配制：臨用前把試劑五、試劑六轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解待用；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL  試劑三，用冰浴 勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿 600g ，4℃離心 5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g ，4℃離心 10min。

4、上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的 ICDHm（此步可選做）。

5、在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體 ICDHm 活性測定。

測定步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm 處，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）孵育 5min。

3、在 1mL 石英比色皿中依次加入 60μL 試劑七、80μL 樣本和 1mL 工作液，混勻，立即記 錄 340nm 處 20s 時(shí)的吸光值 A1 和 2min20s 時(shí)的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

ICDHm 活性計(jì)算

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

ICDHm 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣) ÷T

=1145×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

ICDHm（nmol/min /g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷(ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T

=231.3×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

ICDHm 活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷(ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.463×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.14×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.08 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL； T ：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。