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貨號(hào)：LE-1-199

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：6mol/L 鹽酸，自備。濃鹽酸：H₂O（V/V）= 1:1，室溫保存。

試劑一：液體 15mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體 15mL×1 瓶，4℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1mL×1 支，0.5mg/mL 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，4℃保存。

產(chǎn)品說(shuō)明：

HYP 是機(jī)體膠原蛋白主要成分之一，膠原蛋白大多分布于皮膚、腱、軟骨和血管等，因此 HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

樣品經(jīng)酸水解產(chǎn)生游離的 HYP，進(jìn)一步被氯胺 T 氧化，氧化產(chǎn)物與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)，產(chǎn)生紅色化合物，在 560nm 處有特征吸收峰。通過(guò)測(cè)定樣品水解液 560nm 吸光值，可計(jì)算 HYP 含量。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、烘箱、玻璃管、離心機(jī)、水浴鍋、可見(jiàn)分光光度計(jì)、1 mL 玻璃比色皿、6mol/L 鹽酸和蒸餾水。

操作步驟：

一、羥脯氨酸提取

1、組織：稱取約 0.5g 樣品于玻璃管，將組織盡量剪碎以便消化，蓋子稍松不密閉。加入 5mL 的提取液，煮沸或 110℃烘箱 2 至 6 小時(shí)消化至沒(méi)有可見(jiàn)大的團(tuán)塊，16000rpm，25℃，離心 20min（若離心后仍有雜質(zhì)，可通過(guò)過(guò)濾去除），用 10mol/LNaOH（約 3mL）調(diào)節(jié) pH 值至 6～8 范圍內(nèi)。蒸餾水定容至 8mL，取上清待測(cè)。（過(guò)程中可能有黑色物質(zhì)生成，若長(zhǎng)時(shí)間不能消化，可能為碳化的物質(zhì)）

2、細(xì)胞：取500 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，加入1mL 的提取液，煮沸或110℃烘箱2 至6 小時(shí)消化至透明狀，16000rpm， 25℃，離心 20min，用 10mol/LNaOH（約 0.5mL）調(diào)節(jié) pH 值至 6～8 范圍內(nèi)。蒸餾水定容至 2mL， 取上清待測(cè)。

二、測(cè)定操作：

1、將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為 15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234、0.117μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 560nm，蒸餾水調(diào)零。

3、按下表進(jìn)行操作：

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x 軸，?A 標(biāo)準(zhǔn)（?A =A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）為 y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程 y=kx+b。將?A 測(cè)定（?A =A 測(cè)定管-A 空白管）帶入方程得到 x。

2、羥脯氨酸含量的測(cè)定：

（1）按樣本鮮重計(jì)算：

組織羥脯氨酸含量（μg/g 鮮重）= x×V 樣品÷（W×V 樣品÷V 組提）=8x÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

組織羥脯氨酸含量（μg/mg prot）= x×V 樣品÷（Cpr×V 樣品）=x÷Cpr

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

細(xì)胞羥脯氨酸含量（μg/10⁴ cell）= x×V 樣品÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣品÷V 胞提）=2x÷細(xì)胞數(shù)量。

V 樣品：加入的樣品體積，0.2mL；V 組提：組織提取液體積，8mL；V 胞提：細(xì)胞提取液體積，2mL；W：樣本鮮重，g；細(xì)胞數(shù)量：以 104 為單位，萬(wàn)個(gè)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

注意事項(xiàng)：

1、OD 值大于 1，樣品適當(dāng)稀釋再測(cè)定，注意計(jì)算公式里乘以稀釋倍數(shù)。

2、試劑有一定的毒性，請(qǐng)操作時(shí)做好防護(hù)措施，防止吸入或與皮膚接觸。

3、按樣本蛋白濃度計(jì)算時(shí)，需單獨(dú)提取樣本中的蛋白質(zhì)并測(cè)定。