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ATP 含量試劑盒說(shuō)明書(shū)(微量法)

貨號(hào)：LE-2-295

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

ATP 廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是生物能量通貨，能荷是描述細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的主要參數(shù)。測(cè)定 ATP 含量并且計(jì)算能荷，能夠反映能量代謝狀態(tài)。

測(cè)定原理：

肌酸激酶催化肌酸和 ATP 反應(yīng)生成磷酸肌酸，可在 700nm 下用磷鉬酸比色法檢測(cè)磷酸肌酸 含量， 以此反應(yīng) ATP 含量。

自備儀器和用品：

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/96 孔板、研缽和蒸餾水。

試劑組成和配制：

酸性提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

堿性提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：粉劑×1支，4℃保存；臨用前加入 1mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保 存；

試劑二：液體 1.5mL×1 支，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存； 臨用前加入 500μL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃ 保存一周；

試劑四：液體 5mL×1 瓶，4℃保存；

試劑五：液體 25mL×1 瓶，4℃保存；

標(biāo)準(zhǔn)液：液體 10mL×1 瓶，2μmol/mLATP 標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存；

ATP 提取：

1、血清（漿） 中 ATP 的提取： 按照血清（漿）體積（mL）： 酸性提取液體積（mL）為 1： 5~10 的比例（建議取約 0.1mL 血清（漿），加入 1mL 酸性提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，8000g 4  ℃離心 10min；取上清液至另一 EP 管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，8000g  4  ℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)（不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定）。

2、組織中 ATP 的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議 稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 酸性提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿，8000g  4℃離心 10min，取上清 至另一 EP 管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，8000g  4  ℃離心 10min，取上 清，置冰上待測(cè)（不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定）。

3、細(xì)胞或細(xì)菌中 ATP 的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù) 量（10⁴ 個(gè)）： 酸性提取液體積（mL）為 500~1000： 1  的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 酸性提取液），超聲波破碎 1min（冰浴，強(qiáng)度 20％或 200W，超聲 2s，停 1s），8000g 4 ℃ 離心 10min；取上清液至另一 EP 管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，8000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)（不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定）。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 700nm，蒸餾水調(diào)零。

2、顯色劑的配制： 臨用前請(qǐng)根據(jù)擬用顯色劑體積（樣本數(shù)×0.2 m L）， 按試劑四(mL)：試 劑五（mL）=1： 5 的比例配制。用多少配多少。

3、樣本測(cè)定：

充分混勻，37℃準(zhǔn)確水浴 30min

37℃水浴 20min 后，700nm 下測(cè)定各管吸光值

注意： 空白管和標(biāo)準(zhǔn)管通常只需要各做一個(gè)。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

ATP 含量計(jì)算：

1、血清（漿） 中 ATP 含量計(jì)算

ATP 含 量 (μmol/mL)=[C 標(biāo) 準(zhǔn) 管 ×(A 測(cè) 定 管 －A 對(duì) 照 管 )÷(A 標(biāo) 準(zhǔn) 管 －A 空白 管 ) ×V1]÷(V3×V1÷V2)

=40×(A 測(cè)定管－A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)

2 、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中ATP 含量計(jì)算

（1）按蛋白濃度計(jì)算

ATP 含量(μmol/mg  prot)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×(A 測(cè)定管－A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)×V1]÷(V1÷Cpr）

=2 ×(A 測(cè)定管－A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)÷Cpr

蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定。

（2）按樣本鮮重計(jì)算

ATP 含量 μmol/g 鮮重)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×(A 測(cè)定管－A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管) ×V1]÷(W×V1÷V2)

=4 ×(A 測(cè)定管－A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

ATP 含量(μmol/10⁴  cell） =[C 標(biāo)準(zhǔn)管×(A 測(cè)定管－A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管) ×V1]÷(500×V1÷V2)

=0.008×(A 測(cè)定管－A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)÷W

C  標(biāo)準(zhǔn)管 ：標(biāo)準(zhǔn)液濃度，2μmol/mL；V1 ：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V2 ：加入  提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W： 樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。

注意： 最低檢測(cè)限為 10nmol/mL 或 10nmol/g 鮮重或 0.1nmol/mg prot