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貨號：LE-1-227

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

MCS 廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體基質中，與檸檬酸合酶（CS）共 同參與三羧酸循環(huán)的調節(jié)。

測定原理：

MCS 催化丙酰 CoA 和草酰乙酸產生甲基檸檬酰輔酶 A，進一步水解產生甲基檸檬酸；該反應促使無色的 DTNB 轉變成黃色的 TNB，在 412nm 處有特征吸光值。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、 水浴鍋、可調式移液器、 1mL 玻璃比色皿、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水

試劑組成和配制：

試劑一： 液體 10mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二： 液體 2mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三： 液體 0.2mL×1 支 ，-20℃保存；

試劑四： 液體 10mL×1 瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1支 ，4℃保存，臨用前加入 320μL 無水乙醇；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑六：粉劑×1支 ，-20℃保存， 臨用前加入 320μL 蒸餾水； 用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑七：粉劑×1支 ，-20℃保存， 臨用前加入 320μL 蒸餾水； 用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①   稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1mL 試劑一和 10uL  試劑三 ，用冰浴勻漿器 或研缽勻漿。

②   將勻漿 600g，4℃離心 5min。

③   棄沉淀，將上清液移至另一離心管中， 11000g，4℃離心 10min。

④   上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的 CS（此步可選做）。

⑤   在步驟 ④ 中的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL  試劑三 ，超聲波破碎（冰浴，功率 20% 或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復 30 次），用于線粒體 CS 測定。

測定步驟：

1、分光光度計預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 412nm，蒸餾水調零。

2、將試劑四、五、六和七在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）孵育 5min。

3、樣本測定

將上述試劑按順序加入 1 mL 玻璃比色皿中，加試劑七的同時開始計時，在 412nm波長下記 錄 20 秒時的初始吸光度 A1 和反應 2min 后的吸光值 A2 ，計算 ΔA=A2-A1。

MCS 活性計算：

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。

MCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷( ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=1100×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2、按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。

MCS（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷( ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T

=222.2×ΔA÷W

3、按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。

MCS（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷( ε×d）×10⁹]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T

=0.4444×ΔA

V 反總：反應體系總體積，9×10^-4 L；ε： TNB 摩爾消光系數(shù)， 1.36×10⁴ L / mol /cm； d：比  色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T： 反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量 ，g；500：細胞或細菌總  數(shù)，500 萬。