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甲醛脫氫酶（FDH）試劑盒說(shuō)明書(shū)（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-345

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

甲醛是一種能與蛋白質(zhì)、核酸和脂類產(chǎn)生非特異性反應(yīng)的活潑化合物，對(duì)所有生物都具有很高毒性。甲醛脫氫酶作為含鋅中等鏈醇脫氫酶（ADH）的家庭成員之一，廣泛存在于原核和真核生物中，該酶能利用 NAD⁺作為輔酶，將有毒的甲醛氧化，是甲醛氧化途徑中的關(guān)鍵酶。

測(cè)定原理

甲醛脫氫酶催化甲醛和 NAD⁺ 產(chǎn)生 NADH，在 340nm 處的吸光值會(huì)增加，測(cè)定 340nm 處的吸光值變化，可計(jì)算得到甲醛脫氫酶的活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、離心機(jī)、分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿、蒸餾水。

試劑組成和配制

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 30mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 15mL 水溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃ 保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 3mL 水溶解待用。

試劑四：液體 3mL×1 瓶，4℃避光保存。

FDH 提取

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃，離心 20min。

2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1  的比例（建議 500萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）;然后 10000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3、液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作表

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、操作表

在比色皿中加入如下試劑

混勻，于 340nm 下測(cè)定初始吸光值A(chǔ)1 與 5min 后的吸光值 A2，△A=A2-A1。若樣本數(shù)量較多，可將試劑按比例配成工作液使用。

FDH 酶活計(jì)算:

1、按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘催化還原 1nmol NAD⁺ 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

FDH 酶活（nmlo/min/mg prot）=[△A÷ (ε×d) ]×V 反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 322×△A÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每克樣品每分鐘催化還原 1nmol NAD⁺ 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

FDH 酶活（nmlo/min/mg 鮮重）=[△A÷ (ε×d) ]×V 反總÷（V樣×W÷V 樣總）÷T

= 322×△A÷W

3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化還原 1nmol NAD⁺ 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

FDH 酶活（nmlo/min/10⁴ cell）=[△A÷ (ε×d) ] ×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)））÷T

= 322×△A÷細(xì)胞數(shù)量

4、按液體體積計(jì)算

酶活定義：每 ml 樣本每分鐘催化還原 1nmol NAD⁺ 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

FDH 酶活（nmlo/min/ml）= [△A÷ (ε×d) ] ×V 反總÷V 樣÷T

=322×△A

ε ：NADH 微摩爾消光系數(shù)，6.22×10^-3  L/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，1ml； V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0. 1ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T ，反應(yīng)時(shí)間，5min；Cpr：樣本蛋  白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g