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花青素還原酶（ANR）試劑盒說(shuō)明書（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-188

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

花青素還原酶是黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶，在植物體內(nèi)起非常重要的調(diào)控作用，對(duì)花青素還原酶的調(diào) 控機(jī)制研究有利于從基因水平改變植物的品質(zhì)。

測(cè)定原理：

花青素還原酶在 NADPH 存在的條件下作用于飛燕草色素轉(zhuǎn)變?yōu)楸頉](méi)食子兒茶素和 NADP，使反應(yīng)體 系在 340nm 處的吸光值下降，吸光值下降速率反應(yīng)了花青素還原酶的活性。

試劑的組成和配置：

提取液：液體 50ml ×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 40ml ×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑 ×1 瓶，4℃避光保存 。臨用前加 3ml 蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù) 凍融。

試劑三：粉劑 ×1 瓶，4℃避光保存 。臨用前加 3ml 蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù) 凍融。

試劑四：粉劑 ×1 瓶，4℃避光保存 。臨用前加 3ml 蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù) 凍融。

自備儀器和用品：

天平 、研缽 、低溫離心機(jī) 、紫外分光光度計(jì) 、 1ml 石英比色皿 、蒸餾水。

酶液提取：

1、組織：按照組織質(zhì)量（ g） ：提取液體積(ml)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1ml 提取液） ，進(jìn)行冰浴勻漿 。 10000g  ，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、培養(yǎng)液等液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作表

充分混勻，于 1ml 石英比色皿測(cè)定 340 處吸光值 A1，然后在 40℃溫育 20min 后，再測(cè)定 340nm 處吸光值 A2，△A=A1-A2

酶活性計(jì)算公式:

1、按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義 ：在 40℃,pH6.5 條件下，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmolNADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

ANR 活性（nmol/min/mg prot）= ΔA÷ (ε×d）×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T 

= 80.39×ΔA÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義 ：在 40℃,pH6.5 條件下，每克組織每分鐘催化 1nmolNADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

ANR 活性（nmol/min/g  鮮重）= ΔA÷ (ε×d）×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T 

= 80.39×ΔA÷W

3、按液體體積計(jì)算

酶活性定義 ：在 40℃,pH6.5 條件下，每毫升液體每分鐘催化 1nmolNADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

ANR 活性（nmol/min/ml）= ΔA÷ (ε×d）×V 反總÷V 樣÷T 

= 80.39×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1ml；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0. 1ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；Cpr：樣本蛋白質(zhì) 濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g