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貨號：LE-1-154

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

ACL（EC4.1.3.8）是脂肪酸合成中的關(guān)鍵酶，其催化產(chǎn)生的乙酰輔酶 A 可用于脂肪酸合成和碳鏈延長、黃酮類物質(zhì)合成、氨基酸合成等。

測定原理：

ACL 在 ATP 和輔酶 A 存在的情況下催化檸檬酸裂解為乙酰輔酶 A、草酰乙酸、腺苷二磷酸和磷酸鹽。蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和 NADH 生成蘋果酸和 NAD⁺，在 340nm 測定 NADH 減少速率，計算 ACL 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：液體 5μL×1 支，4℃保存；

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1）工作液的配置，將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中，充分混合溶解，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；（注意：可取少量試劑一至試劑二和試劑三中，充分混勻溶解后轉(zhuǎn)移至試劑一瓶中，重復(fù) 2-3 遍）；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

（2）在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本和 950μL 工作液，混勻，立即記錄 340nm 處 20s 時的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2，計算 ΔA=A1-A2。

ACL 活性計算：

a.  用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）ACL 活力計算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

ACL（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T

=1608×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 ACL 活力計算

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

ACL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=1608×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

ACL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T

=1608×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位定義：每 1 萬個細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

ACL（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=3.216×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。