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DPPH自由基清除能力測試盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-168

正式測定前務(wù)必取 2-3  個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體 50 mL×1  瓶，4℃保存；

試劑一：無水乙醇 60 mL×1  瓶，自備，室溫保存；

試劑二：粉劑×1  支（0.6 mL EP 管放于 8 mL 試劑瓶中），4℃保存。臨用前加入 6.08 mL 試劑一振蕩溶解，用不完的試劑可于-20℃保存一月，建議分裝保存；臨用前根據(jù)試驗所需量按照試劑二： 試劑一（V:V）= 4：21 的比例配制成工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用，用不完的工作液可于 4℃保存一周；

試劑三：粉劑×1 支，10 mg 維生素 C，4℃保存。臨用前加入 1 mL 提取液，充分振蕩溶解；配成10 mg/mL 維生素 C 溶液，用于陽性對照。

產(chǎn)品說明：

DPPH 自由基一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，是樣本抗氧化能力的重要指標(biāo)之一，廣泛應(yīng)用于抗氧化類食品、保健品及藥品的研究中。

DPPH 自由基有單電子，其醇溶液呈紫色，在 515 nm 處有強吸收。當(dāng)有抗氧化劑存在時，DPPH 自由基被清除，其溶液顏色變淺，515 nm 的吸光度下降，在一定范圍內(nèi)其吸光度的變化與自由基被清除的程度成正比。本試劑盒中，通過吸光度下降的程度來反映樣本清除 DPPH 自由基的能力。

自備實驗用品：

可見分光光度計、恒溫水浴鍋、1 mL 玻璃比色皿、臺式離心機、無水乙醇、研缽/粉碎機、烘干箱、30~50 目篩和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣品的制備

1、植物樣本的制備：將新鮮樣品置于 60℃烘箱烘干至恒重，研缽研碎（或粉碎機粉碎），過30~50  目篩。稱取約 0.05 g  樣本，加入 1 mL 提取液，40℃水浴浸提 30 min。室溫10000 rpm 離心10 min， 取上清，置冰上待測。

2、紅酒、果汁等液體樣本：吸取 100 μL 樣本溶液加入 900 μL 提取液，旋渦振蕩混勻，室溫10000 rpm離心10 min，取上清，置冰上待測。

3、提取物或者藥物：可用提取液配制成一定濃度，如 5 mg/mL。

注意：

不同樣本清除 DPPH 自由基的能力可能相差很大，為保證實驗結(jié)果的準確性，樣本要根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果進行適當(dāng)調(diào)整（如清除率大于 90%，建議將提取的樣本用提取液進行稀釋；清除率小于 5%， 建議加大烘干樣本質(zhì)量或液體樣本體積進行提取）。

二、測定步驟

1、分光光度計預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長至 515 nm，無水乙醇調(diào)零。

2、陽性對照的準備：若需要線性關(guān)系，建議將10 mg/mL 的維生素 C 溶液用提取液配制成 0.3、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/mL 的維生素 C 溶液待用；若需要清除率約為 100%的陽性對照，則建議將 10 mg/mL 維生素 C  溶液用提取液配制成大于 0.3 mg/mL 的維生素 C 溶液待用。

3、操作表：在 1.5 mL EP 管中分別加入下列試劑

三、計算公式

1、陽性對照的自由基清除率計算公式：

DPPH 自由基清除率 D_VC% =[(A 空白-A 陽性對照)÷A 空白]×100% 

2、樣本的自由基清除率計算公式：

DPPH 自由基清除率 D% =[[A 空白-(A 測定-A 對照)]÷A 空白]×100%

注意事項：

1、不同樣本清除 DPPH 自由基的能力可能相差很大，如果要比較不同樣品的 DPPH 自由基清除能力，建議對于同一批樣品加入等量的樣品，紅酒、組織勻漿、果汁等液體樣品加入同樣體積，提取物（或者藥物）配制成同樣濃度。在比較時，將樣本根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果進行適當(dāng)調(diào)整，比較同樣濃度（相同稀釋倍數(shù)）的清除率大小。

2、樣品建議當(dāng)天提取當(dāng)天檢測。