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4-香豆酸：輔酶 A 連接酶（4CL) 試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-209

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

4CL 是連接苯丙酸途徑與木質(zhì)素特異合成途徑的關(guān)鍵酶，主要催化肉桂酸生成相應(yīng)的肉桂酸 輔酶 A 酯，是合成木質(zhì)素與其他苯丙烷類化合物的代謝流向調(diào)控點。該酶主要存在于高等 植物、酵母和菌類中，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理， 為減少水果石細(xì)胞含量而提高其品質(zhì)提供依據(jù)。

測定原理：

4CL 催化 4-香豆酸和CoA 生成 4-香豆酸 CoA，在 333nm 下測 4-香豆酸 CoA 生成速率，即 可反映 4CL 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 60 mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×2 瓶，-20℃保存；

粗酶液提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000 ：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提 取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計 40℃預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 333nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

①  在試劑二中加入 12.5mL 試劑一充分溶解混勻，置于 40℃水浴預(yù)熱 10min；現(xiàn)配現(xiàn)用 （配好后 24h 內(nèi)用完）；

②  測定管：在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本和 950 μL 試劑二，混勻，立即記錄 333nm 處 40℃反應(yīng) 30min 后的吸光值 A2。

對照管：在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本和 950μL 試劑一，混勻，立即記錄333nm 處 40℃反應(yīng) 30min 后的吸光值 A1 ，計算 ΔA=A2-A1。 注意：每個測定管設(shè)一個對照管。 

4CL 活性計算：

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol4-香豆酸輔酶 A 定義為一個酶活力單位。 

4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=31.75×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計算：

單位定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶 A 定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T

=31.75×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶 A 定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=0.063×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：4-香豆酸輔酶 A 摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L / mol /cm； d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL； T：反應(yīng)時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì) 胞總數(shù)，500 萬。