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超氧陰離子(Superoxide anion, OFR)試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-162

正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義

生物體內(nèi)超氧陰離子等活性氧具有免疫和信號傳導(dǎo)的作用，但積累過多時會對細胞膜及生物 大分子產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致機體細胞和組織代謝異常，從而引起多種疾病。

測定原理

超氧陰離子與鹽酸羥胺反應(yīng)生成 NO₂^- ，NO₂^- 在對氨基苯磺酸和 α-萘胺的作用下，生成紅 色的偶氮化合物，在 530nm 處有特征吸收峰，根據(jù) ΔA 值可以計算樣品中  O₂^- 含量，反應(yīng)式 為 NH₂OH + 2O₂^- + H⁺ → NO₂^-  + H₂O₂ + H₂O。

自備實驗用品及儀器

天平、水浴鍋、離心機、可見分光光度計、1 mL 玻璃比色皿、氯仿和蒸餾水。

試劑組成和配制

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 20mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體 20mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑四：氯仿，自備。

超氧陰離子提取

1、植物、動物組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）進行冰浴勻漿，然后 10000g ，4℃, 離心 20min，取上清 置于冰上待測。。

2、細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000 ：1  的比例（建 議 500 萬細胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 10000g ，4℃,離心 20min ，取上清置于冰上待測。

3、血清或培養(yǎng)液：直接測定。

測定操作表

超氧陰離子含量計算公式

標準曲線：y = 0.0242x - 0.0027 ，R² =0.9980

1、組織：

（1）按照樣本質(zhì)量計算

超氧陰離子含量（nmol/g 鮮重）= (ΔA +0.0027)÷0.0242×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)×2 

=148.76×(ΔA +0.0027)÷W

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ g·min）=148.76×(ΔA+0.0027)÷W÷T

=7.44×(ΔA +0.0027)÷W

（2）按照蛋白質(zhì)濃度計算

超氧陰離子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反總÷(V 樣×Cpr)×2 

=148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ mg prot·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr÷T 

=7.44×(ΔA+0.0027)÷Cpr

2、細菌，真菌：

超氧陰離子含量（nmol/10⁴ cell）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細胞數(shù)量)×2 

= 148.76×(ΔA+0.0027)÷細胞數(shù)量

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/10⁴ cell·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷細胞數(shù)量÷T 

=7.44×(ΔA+0.0027)÷細胞數(shù)量

3、血清或培養(yǎng)液

超氧陰離子 含量（nmol/mL）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反總÷V 樣×2

=148.76×(ΔA+0.0027)

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/mL·min）= 148.76×(ΔA+0.0027) ÷T

= 7.44×(ΔA+0.0027)

V 樣總：加入提取液體積，1 mL； V 反總：反應(yīng)總體積，0.9mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.5mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，20min；2 ： 2分子 O₂^-  參與反應(yīng)生成 1 分子 NO₂^- 。

注意事項

1、吸光值大于 2 ，樣品適當稀釋再測定，注意計算公式里乘以稀釋倍數(shù)。

2、樣品制備好之后，立刻進行測定，請勿將樣品進行長時間的低溫保存，以免影響測定結(jié) 果。

3、試劑四有一定的毒性，請操作時做好防護措施。