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結(jié)合態(tài)淀粉合成酶試劑盒說明書（分光光度法-25管/24樣）

貨號：LE-1-091

測定意義

GBSS（EC  2.4.1.21 ）以束縛態(tài)存在于淀粉體中，催化淀粉鏈的加長反應(yīng)，主要負責直鏈淀 粉的合成。

測定原理

GBSS 催化 ADPG 與淀粉引物(葡聚糖)反應(yīng),將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上，同時生成 ADP；進一步通過反應(yīng)體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催 化 NADP+還原為 NADPH ，其中 NADPH 生成量與前一步反應(yīng)生成的 ADP 數(shù)量呈正比，通 過 340nm 下測定 NADPH 的增加量，可以計算 GBSS 活性。

需自備的的儀器和用品

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存； 

試劑一：25mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入 7mL 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入 4mL 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入 9mL 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑五：液體×1支， -20℃保存；臨用前加入 0.5mL 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑 分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑六：粉劑×1支， -20℃保存；臨用前加入 0.5mL 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑 分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

粗酶液制備

稱取 0.1~0.2g 組織（建議稱取約 0.1g 組織），加入 1mL 提取液，冰浴中勻漿。10000g  ，4℃ 離心 10min，棄上清，在沉淀中加入 1mL 提取液充分混勻，置冰上待測。

測定步驟

1、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、在 EP 管中按順序加入下列試劑

混勻，30℃保溫 20 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻

混勻，30℃保溫 30 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻，10000g 4℃  離心 10min，取上清液（如果一次性測定樣本較多，可將試劑四、五和六按比例配成混合液）

混勻后立即 340 nm 波長下記錄初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2，計算 ΔA=A2-A1。 

注意：試劑二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混勻。

GBSS 活性計算

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。 

GBSS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷  ( ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣) ÷T×稀釋倍數(shù)

=529×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按照樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

GBSS 活性（nmol/min /g  鮮重）=[ΔA×V 反總÷  ( ε×d）×10⁹]÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T×稀釋 倍數(shù)

=529×ΔA÷W

V  反總：反應(yīng)體系總體積，7.8×10^-4  L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³  L / mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.15 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應(yīng)時間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.267；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。